荧光原位杂交FISH课件.pptVIP

寡核苷酸探针 它是根据探针靶序列的碱基顺序用化学方法合成的单链DNA，其长度为15-20核苷酸。由于分子小，因此更容易渗透到细胞的目标区域；但也正由于分子小，限制了其所能携带的荧光基团或报告分子数目，并最终导致杂交后荧光信号较弱。因此这类探针仅实用于对重复单位较短的高度重复序列的荧光原位杂交分析。 探针标记 为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。 荧光原位杂交得探针常用荧光素或地高辛进行标记。 探针标记可以采用均匀标记和末端标记的方法。 对探针进行标记时，可复制合成一段新探针分子，在复制合成过程渗入标记核苷酸，从而使整个新分子被均匀地标记。其显著的特点是标记不局限一个位点，而是均匀地渗入，探针的信号强。 均匀标记有切口平移法、随机引物法和PCR扩增等方法。 均匀标记 切口平移法可对环状或线性双链DNA进行标记。一般对克隆的DNA片段用这种方法标记的效果较好。 该方法使用时应注意： A.只能标记双链DNA 使用探针时要预先变性后再使用，而且标记时DNA片段不太小 B. DNA酶I使用的量要合适 太多会将DNA模板切碎，不能进行标记反应；太少则不能有效地打开缺口，使标记物不能进入缺口 C. 标记时间不能太短 太短时间会造成标记量不足，影响杂交的进行 1、不但可用于双连DNA的标记，而且可用于单连DNA和RNA的标记 2、操作简单 3、标记率高 末端标记 直接将探针分子的某个原子替换为放射性同位素原子，或直接在探针分子上加上标记的原子或复合物，这种直接标记一般是在探针分子的末端进行，所以称之为末端标记。 经过末端标记的核酸分子除作为杂交探针外，更多的用于RNA S1作图以及引物延伸反应中的标记引物。 LOGO swu swu swu swu * 荧光原位杂交(FISH) 原位杂交（ISH） 原位杂交 (in situ hybridization, ISH) 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交。 原位杂交技术(ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。 使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。 基本原理 根据碱基互补配对原则，同源的DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA两条单链在一定条件下能结合成双链。用放射性或非放射性物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补的cDNA作探针，与组织切片或细胞内待测核酸(RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的 mRNA或DAN 的存在与定位。 3H、35S、125I、32P等 放射性同位素 1 2 荧光素、生物素、地高辛等 非放射性物质 2 同位素原位杂交的不足之处： 1、不稳定 2、高背景 3、曝光时间长 4、结果统计处理繁琐 5、同位素的使用和处理 几种原位杂交技术 1 基因组原位杂交技术 2 荧光原位杂交技术 3 多彩色荧光原位杂交技术 4 原位PCR 荧光原位杂交 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization， FISH）是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，探针首先与某种介导分子(reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。 FISH的基本原理 FISH基本原理是利用同源互补的待检染色体与用生物素、地高辛标记过的核酸探针,经变性- 退火- 复性,形成待检DNA与核酸探针的杂交体。使探针与荧光素标记的特异亲和素之间发生免疫化学反应,最后用荧光显微镜对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 发展历史 1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。 20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交，即FISH技术。 1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。 1969 年Gall 和Pardue 以及Pardue 等人利用放射性同位素标记的核酸探针对DNA进行了杂交,开创了RNA-DNA 的同位素原位杂交技术。 他们都是采用放射性同位素标记探针,需要采用放射自显影进行检测,这种检测上的限制及当时分子克隆方法的缺乏使得DNA原位杂交技术不能很快得到广泛应用。 1974 年，Evans第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来,提高了基因定位