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第四章 蛋白质共价结构 蛋白质共价结构内容提要 §4-1 蛋白质通论 §4-2 蛋白质的共价结构-肽 §4-3 蛋白质一级结构的测定 §4-4 多肽与蛋白质的人工合成 §4-1 蛋白质通论 一、蛋白质概念 蛋白质是由20种a-氨基酸通过肽键组成的高分子有机物. 二、蛋白质的化学组成 蛋白质由C、H、O、N四种元素组成，多数含有S，有的含有微量铁、铜、锌、碘和磷等元素。 各种蛋白质的含氮量都接近于16％是测定蛋白质含量的基础。 蛋白质的构象测定 x-射线衍射法：x-射线衍射法是测定蛋白质晶体结构的极其重要而有效的方法。 X-射线衍射分析需要单晶制品。结晶的蛋白质具有结构均一性，是高纯度的。 核磁共振(NMR)：根据外磁场存在下某些原子核吸收射频能量发展起来的波谱分析技术。 二维核磁共振是测定溶液中蛋白质等生物大分子三维结构的唯一方法。 根据氨基酸序列预测，例如统计学方法：统计出各残基或二肽、三肽片段在有序结构中出现的频率、用以计算预测其形成二级结构的可能性。 六、蛋白质功能的多样性 作为有机体新陈代谢的催化剂（酶）。 生物体的结构成分(胶元蛋白)。 贮藏功能（作为生物体养料和胚胎或幼儿生长发育的原料。） 运输功能（血红蛋白）。 运动功能（肌动蛋白和肌球蛋白） 调节功能（激素） 参与高等动物的免疫反应（抗体和免疫蛋白）。 控制或调节遗传物质核酸的作用（组蛋白）。 提供能量 §4-2 蛋白质的共价结构-肽（peptide） 一、蛋白质的一级结构 1969年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC）规定：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中AA的排列顺序，包括二硫键的位置。 多肽链即为蛋白质一级结构的主体。-NCCNCC- 二、肽键（peptide bond） -C-N-比大多数C-N键短，具有部分双键性质，不能自由旋转。 -C-N-键上的H和O原子是反式的。 组成肽键的原子处于同一平面（肽平面）。 三、肽平面 -CO-NH-中的四个原子和与它相邻的两个Ca在一个平面上。 在肽链中，任何α—碳原子的二面角发生变化，肽链主链骨架的构象必然发生相应的变化。如果所有的α—碳原子的二面角都相等，则主链骨架的构象一般足螺旋构象；如果二面角分别等于+—180’，则呈现充分仲展的构象。螺旋构象Φ为-57，Ψ为-47 四、肽链的方向性 五、天然存在的活性肽（active peptide） 生物体内以游离态存在的分子量较小的多肽，这类多肽通常都具有特殊的生理功能。 如催产素、加压素、谷胱甘肽、脑啡肽、激素类多肽、抗菌肽、蛇毒多肽等。 谷胱甘肽 §4-3 蛋白质一级结构的测定 蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目、多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。 一、测定蛋白质的一级结构的要求 样品必需纯（97%以上）； 知道蛋白质的分子量； 知道蛋白质由几个亚基组成； 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。 蛋白质一级结构测定的基本策略 1、测定蛋白质中多肽链的数目； 2、拆分蛋白质分子的多肽链，分离纯化各肽链； 3、拆开多肽链内的二硫键； 4、分析各肽链的氨基酸组成； 5、鉴定多肽链的氨基末端残基和羧基末端残基； 6、用两种不同的裂解方式裂解多肽链成较小的片段； 7、测定各片段的氨基酸顺序； 8、用片段重叠法重建完整多肽链的一级结构； 9、确定二硫键的形成方式。 测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。 多肽链的拆分 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基). 二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的?-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。 可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法拆分多肽链间的二硫键。 4、 氨基酸组成的测定 酸水解是主要水解方法，同时辅以碱水解。 酰胺基：总量可由水解液中的氮量算出； 色氨酸：可用碱水解蛋白质，能定量回收色氨酸。 N-末端分析方法 注意环肽和基团的修饰 （1）二硝基氟苯（DNFB）法 Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，