实验四 荧光显微镜细菌计数　.pptVIP

实验四 荧光显微镜细菌计数;二、实验原理 吖啶橙(Acridine Orange)是吖啶的衍生物之一。它是一种荧光染料，激发峰492nm，荧光发射峰530nm(DNA)，640nm(RNA)，它与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光(给502nm)激发下，DNA发出绿色荧光(约530nm)，RNA发桔红色荧光(＞580nm)。吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示DNA、RNA两种核酸。细菌经吖啶橙染色后，在荧光显微镜下观察，活细胞呈橙色荧光，而死细胞呈绿色荧光。 ;三、实验材料 1、细菌水样 2、试剂： 1）吖啶橙（AO） 吖啶橙（AO）染色液：将0.1g吖啶橙染色剂溶于100ml蒸馏水，经0.22μm滤膜过滤。可于冰箱4度中存放两周。 2）甲醛溶液 经0.22μm滤膜过滤的40%（V/V）甲醛溶液。 3） 无菌水、低荧光浸润油等。 3、主要仪器设备 荧光显微镜、抽滤装置、微孔滤膜、一次性手套、载玻片、盖玻片 ;四、实验步骤 1、滤器装配 放置滤膜（光滑面朝上）装好滤器及抽滤装置。 2、细菌染色 加5ml蒸馏水于滤器中，移入适量样品（控制在每个视野出现菌体50个左右），再滴入10％的吖啶橙，混匀，染色2min。 3、抽洗滤膜 用蒸馏水淋洗滤器内壁2-3次，并抽滤至滤膜刚好呈湿润状态。 4、制片 加一滴荧光显微镜油于载玻片上，贴上载菌体的滤膜，再向滤膜加一滴油，盖上盖玻片（滤膜两面均不能有气泡）。;五、实验结果 1. 显微计数：在荧光显微镜镜下，随机取20个视野，计算呈亮绿色和桔红色的个体数。 2. 计算样品含菌数。