2011年医学院生殖专业研究生开题报告.pptVIP

# 探究卵子和胚胎内UCP2基因与蛋白的表达情况及其抗氧化作用机制 研究生： 胡 * 导 师： 黄** 教授 董** 教授 葛** 助理研究员 日 期： 2010年 9月 研究的理论基础与研究现状 研究目的与内容 研究方案的可行性分析 拟解决的关键问题 目前实验进展和下阶段的实验安排 课题研究的创新点 卵子线粒体的重要作用 细胞凋亡 能量代谢 参与ROS调节 线粒体 卵子 Ucoupling protein2 氧化 磷酸化 ATP 偶联 以热量散失 ROS—活性氧 细胞凋亡 解偶联 钙离子失衡 质子梯度 UCP2的生化作用 UCP2 Ca2+稳态 能量代谢 ROS 卵子成熟与受精率、胚胎的发育潜能 ？ 卵子线粒体 UCP2与卵子线粒体 UCP2的研究现状 Lacraz等 成年 UCP2(-/-)小鼠 UCP2与ROS的产生调节强相关 Teshima等 心肌细胞 UCP2能显著阻止H2O2诱导的线粒体膜电位的丧失，钙失衡与ROS Duval等 UCP2反义寡核苷酸预先处理猪内皮细胞 线粒体内膜电位和胞内ROS特异性增加 Rousset等 雌性小鼠的生殖道 UCP2特异性表达于排卵前卵泡内的颗粒细胞中 Masaki等 小鼠子宫 妊娠后UCP2含量显著增加。且UCP2（-/-)的小鼠生殖能力显著下降，产仔密度和数量显著降低 但目前，对于卵母细胞及其胚胎中UCP2的表达和卵子自身抗氧化作用机制的研究还很缺乏 研究目的 小鼠卵子和胚胎中是否存在UCP2表达 UCP2从小鼠卵子GV期到胚胎种植前这整个阶段的表达变化情况如何 探究UCP2与卵子成熟率、受精率以及胚胎发育关系 探究应对外界氧化刺激时UCP2的表达调节机制 研究内容 检测小鼠卵子中UCP2基因与蛋白是否有表达；从GV期到囊胚阶段的整个过程中UCP2的mRNA和蛋白的表达变化趋势如何。 对小鼠不同阶段的卵子进行体外培养，评价其发育潜能，检测不同成熟率与受精率的卵子中UCP2mRNA与蛋白的表达量是否存在差异。 对小鼠同一时期的卵子进行不同程度的超氧化环境刺激，检测UCP2的表达变化。 技术路线1.UCP2的表达变化趋势 UCP2的表达情况 线粒体ROS水平 线粒体的功能测定 线粒体膜电位 ATP含量 体内获得的GV期卵子 体内获得的MI卵子 体内获得的成熟卵子 与UCP2表达水平的关系 UCP2的表达 ROS水平的测定 ATP含量的测定 体外培养IVM 成熟卵子 未成熟卵子 体外受精IVF 能受精卵子 未能受精的卵子 技术路线2.UCP2与卵子成熟与受精的关系 体内获得的受精卵 体内获得的2cell 体内获得的桑葚胚 UCP2的表达 ROS水平的测定 ATP含量的测定 体内获得的4cell 体内获得的囊胚 根据是否能发育到下一阶段以及胚胎形态学的指标 技术路线3.UCP2与胚胎发育的关系 发育潜能高组 发育潜能低组 处在同一时期的高发育潜能的卵子 空白对照组 H2O2处理组 技术路线4.抗氧化能力与UCP2关系的探讨 UCP2的表达量随H2O2浓度变化的关系 方案可行性分析 UCP2-ROS的抗氧化作用机制已发现在机体的多种组织和细胞（心肌细胞和肝细胞）中发挥重要的作用。 在女性生殖方面，已经被报道的UCP2在子宫内膜、卵巢组织和卵母细胞外周的颗粒细胞等均有表达。 能量代谢与生殖细胞的发育潜能直接相关，若UCP2在卵母细胞或胚胎中明显表达，它的作用不容忽视。 因此卵母细胞自身存在UCP2的表达以及发挥重要的抗自身氧化的作用机制是十分有可能的。 预期结果 在卵子和胚胎中有UCP2mRNA和蛋白的表达 UCP2在各个时期卵子和胚胎中的表达量不同 UCP2的表达量与胚胎发育潜能密切相关：高发育潜能的卵子或胚胎中UCP2高表达 UCP2-ROS是卵子或胚胎的自身抗氧化机制之一：通过UCP2的高表达来抑制ROS带来的氧化损伤 现阶段的研究进度 初步建立卵子和胚胎中UCP2mRNA的qRT-PCR的检测方法 后续实验的进度安排 2010.9~ 2010.10 验证QPCR的目的条带是否为小鼠卵子UCP2的mRNA表达 优化QPCR的扩增与荧光收集信号的反应条件 2010.10~ 2010.11 抽提卵子蛋白（采用超声破碎等方法），进行Western Blot。 2010.12~ 2011.1 收集GV、MI、MII卵子以及受精卵和后续的各阶段胚胎，分别进行UCP2mRNA和蛋白的表达量的测定 2011.2~ 2011.4 对各个时期的卵子的ROS、ATP和线粒体的膜电位进行测定。