分子生物学分子杂交技术.pptVIP

# 预杂交 为减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，杂交前用封闭物将这些非特异位点封闭。 变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在交杂反应中可大大减少探针的非特异性结合，使背影清晰。 高分子化合物：某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力。一般常用Denhard`t溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖。 分子杂交技术—基本流程 样品及探针制备 样品电泳分离 转膜 预杂交 杂交 洗膜 分析（压片、显色、荧光观察等） 分子杂交技术 Southern blot DNA提取 酶切 电泳/拍照 转膜/固定 探针制备 预杂交 杂交 洗膜 扫磷屏 分子杂交技术 UV交联仪 多用途254nm紫外辐射系统，主要用于将核酸交联于膜上。还用于琼脂凝胶中DNA的切割，RecA突变筛选，胸腺二聚体产生的部分限制性内切酶消化，UV灭菌消除PCR污染。另紫外灭菌-聚合物紫外处理。 分子杂交技术 Southern blot 应用 DNA多态性分析（RFLP分析/SNP/SSCP/RAPD） 基因突变检测 基因copy数检测 重组子筛选 DNA指纹分析 测序 分子杂交技术 Southern blot 应用 DNA指纹分析 血迹中的DNA 分子杂交技术 Northern blot 基因表达分析 mRNA长度及半定量分析 RNA 分子（TRIzol） 甲醛变性电泳 至膜上 转膜 杂交、显影 凝胶 滤膜 用10xSSC转移RNA 吸附有RNA片段的膜（亚甲蓝染色） 带有RNA片段的凝胶 分子杂交技术 Western blot 蛋白提取/样品准备 SDS电转/丽春红S染色 封闭 一抗孵育 洗涤一抗 二抗孵育 洗膜 结果观察/显色（Dig-AP/FITC） 组织蛋白 分子杂交技术 ISH 胚胎/组织制备固定 消化/再固定/洗涤 RNA探针制备 封闭 杂交/洗涤 一抗/洗涤 二抗/洗涤 显色(Dig-、FITC、Cy5) 抗衰老基因Klotho原位杂交图 斑马鱼krox20基因原位杂交图 3,5菱脑节 分子杂交技术 FISH 生物芯片Biochip 生物芯片 定义：在斑点杂交基础上，模拟制备大规模集成电路的基本原理，集成了探针原位合成、照明平板印刷、精密控制、激光共聚焦显微技术发展来的一门分子生物学技术 原理：将大量样本固定于较小的支持物上，然后与标记好的待测样品杂交，再检测杂交信号的强弱，从而判断样本中待测DNA、RNA、Pr等分子数量或活性状态 特点：高通量、微型化、集约化、标准化等 生物芯片 生物芯片 种类 微阵列芯片（基因芯片/蛋白芯片/细胞芯片等） 微流控芯片（属于主动式芯片，如样品制备芯片、PCR芯片、毛细管电泳芯片和色谱芯片等） 芯片实验室（以生物芯片为基础的集成化分析系统 ;可完成如样品制备、试剂输送、生化反应、结果检测、信息处理和传递等一系列复杂工作 ） 生物芯片 基本流程： 芯片制备 原位合成法原位光照蚀刻 微量点样法 样品制备（Sample-Cy3；Control-Cy5） 分子杂交 检测分析（Confocus、CCD） 生物芯片 原位光照蚀刻原理 石英片氢化后封闭 设计11um见方窗口遮罩对封闭部分光解 将nt加入通过化学偶合连接到晶片上 更换不同的遮罩进行UV光解 加入nt进行化学偶合反应 重复上两步可合成所需长度及序列的寡核甘酸 生物芯片 微量点样制备 生物芯片 激光共聚焦显微镜 生物芯片应用 抗体芯片（Ab Microarray 380 ） 第一张商品化的抗体芯片是由美国BD Clontech公司推出的。这是一张用于研究抗体的芯片，芯片上排列了378种已知蛋白的单抗，这些单抗对应的蛋白都是细胞结构和功能上十分重要的蛋白，涉及信号传导、肿瘤、细胞周期调控、细胞结构、细胞凋亡和神经生物学等广泛的领域。通过这张芯片，在一次实验中就能够比较几百种蛋白的表达变化 生物芯片应用 测序 基因芯片的测序原理图 生物芯片 基因表达 生物芯片应用 基因诊断 DNA结构检测 RNA表达检测 能诊断癌症的基因芯片 生物芯片应用 药物研究与开发 与药物代谢相关基因芯片 生物芯片应用 中医药研究 中药特性 中药药理 中药药效 生物芯片应用 用药个体化检测 个体化药物治疗基因检测芯片 选择=结果 汇报结束 谢谢观看！ 欢迎提出您的宝贵意见！ 厚德 博学 精诚 济世 分子生物学 第五章 分子杂交技术 厚德 博学 精诚 济世 分子生物学 第五章 分子杂交技术 申川军 广州中医药大