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质粒的稳定性 质粒稳定性的检测方法： 100% 一定代期或时间 选择性培养基 ? 非选择性培养基 ? ? ? ? ? ? ? ?非选择性培养基(M) ? 选择性培养基(m) 质粒丢失率 = (M-m)/M ×100% 质粒不稳定性的分类 分离不稳定性(segregational instability)： 质粒在细胞培养过程整个质粒的丢失 结构不稳定性(structural instability)： 重组质粒外源DNA的丢失或发生缺失、插入、重排等 分离不稳定的影响因素与改善途径 影响因素 载体类型 克隆DNA的来源 质粒大小 质粒拷贝数 分配功能 温度 改善途径 选择恰当质粒 确定适宜的克隆基因来源 限制插入片断大小 用高拷贝数质粒 引入稳定功能或编码必需产物的基因 结构不稳定的影响因素与改善途径 影响因素 强启动子的存在，产物过量可能影响质粒的复制等功能 DNA复制时经过单链为中介，引起分子内重排 DNA重复序列在复制时引起缺失 改善途径 用低拷贝数质粒或染色体插入载体 用热诱导启动子，时间控制基因表达 引入使单链DNA高效转化为双链DNA的序列 除去引起缺失作用的序列 期中思考题 请各列举1个可应用微生物来解决的实际问题和不可应用微生物来解决的实际问题，并简单说明理由。 你只闻到我的香水，却没看到我的汗水。 你否定我的现在，我决定我的未来！ 你嘲笑我一无所有，不配去爱，我可怜你总是等待。 你可以轻视我们的年轻，我们会证明这是谁的时代。 梦想是注定孤独的旅行，路上少不了质疑和嘲笑， 但那又怎样？ 哪怕遍体鳞伤，也要活得漂亮！ 克隆载体与表达载体 克隆载体：拷贝数高，利于得到基因 表达载体：表达量高，利于得到蛋白 这两类载体没有绝对的区别。 质粒(plasmid) 一种染色体外遗传因子，为闭合的环状双链DNA分子，大小从10-1~102kb不等，可以自我复制并且在细胞分裂时保持恒定地传递给子代细胞。 质粒DNA带有与质粒复制有关的基因、抗药性基因以及其他一些基因，这些基因表现为与宿主有关的性质，如转移、稳定性、分泌性质、特殊的代谢途径、限制、修饰等。 拷贝数：一个细胞内质粒DNA分子的个数，与质粒复制区的结构有关。 质粒的类型 复制类型： 严紧型：质粒DNA复制较严格受染色体DNA复制控制，复制时需有新的蛋白质合成，一般拷贝数较少。 松弛型：质粒DNA复制不受染色体DNA复制控制，复制时不需要新的蛋白质合成，一般拷贝数较多。 接合类型（根据其引起细菌接合转移的能力）： 接合(conjugative)质粒：有Tra基因，一般较大，拷贝数较少。 非接合(non-conjugative)质粒：没有Tra基因。 质粒的制备 培养、收集带质粒的细胞 裂解细胞（生物、化学、物理） 除去核酸外的其它细胞成分（苯酚、氯仿） 除去染色体DNA、RNA（生物、化学、物理） 浓缩、纯化 质粒载体 能在受体系统复制 有尽可能多的限制酶的单一切点 有正选择标记 分子量较小（拷贝数高、转化效率高、操作方便等） 能高效表达外源基因 在细胞分裂时保持稳定 外泌性、不可转移性等 穿梭(shutle)质粒 噬菌体 噬菌体是以细菌为宿主的病毒，由遗传物质核酸与蛋白质外壳组成，只有在宿主细胞里才能繁殖。 按形状分类： 蝌蚪状噬菌体(T4)、球状噬菌体(?X174)、线状噬菌体(Ff) 按遗传物质分类： RNA噬菌体(MS2)、单链DNA噬菌体(M13)、双链DNA噬菌体(λ) 按于宿主的关系分类： 烈性噬菌体、温和噬菌体 温和噬菌体可能构建为载体 温和噬菌体的生活史 非溶源菌 溶源菌 溶源化 感染 复愈