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387 ?论著?文章编号:1007-8738(2005 03-0387-03 鸡白细胞介素22基因真核表达载体的构建及鉴定 提金凤, 郝贵杰, 张艳梅, 邵卫星, 彭大新, 刘秀梵3(扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室, 江苏扬州225009 [摘要]　目的:构建鸡白细胞介素22(I L 22 真核重组表达质 粒, 体外鉴定其能否表达。方法:将鸡I L 22c DNA (RT 2PCR 法获得 , 克隆入真核高效表达质粒pcDNA3. 1(+ 中, 构建 pc DNA 2I L 22重组表达质粒。PCR 和双酶切的方法鉴定克隆的 正确性。然后构建pc DNA 2I L 2GFP 重组表达质粒(即GFP 基因与I L 22的一段上游基因融合表达 , PCR 方法鉴定克隆的正确性。脂质体法转染COS 21细胞, 荧光显微镜下观察荧光。结果:正确构建了真核重组表达质粒pc DNA 2I L 22和pc DNA 2 I L 2GFP 。荧光显微镜下可观察到很强的绿色荧光。结论:鸡I L 22克隆和表达成功。为下一步用重组质粒pc DNA 2I L 22免疫BALB /c小鼠, 研制鸡I L 22单克隆抗体奠定了基础。[关键词]　白细胞介素22; 绿色荧光蛋白; 表达; 鸡[中图分类号]　R392. 12　　　[文献标识码]　B 　　白细胞介素22(I L 22 是一种多效性的细胞因子, 具有多种免疫学功能, 如介导T 细胞增殖; 诱导CT L 、NK 、LAK 等多种杀伤性细胞的分化和效应功能, 并诱导其产生I F N γ2、T NF α2 等细胞因子; 促进B 细胞增殖, 分化和I g 分泌; 活化巨噬细胞等[1]。其免疫效应为在与靶细胞上的I L 22受体(I L 2 2R 结合后, 可介导某些非增殖依赖性功能, 如促进转铁蛋白 受体的表达, 增强CT L 、NK 细胞、LAK 细胞的杀伤活性及诱导I F N γ2分泌等[2]。为了有效的鉴定鸡重组I L 22的表达、表达量及鸡体内I L 22的一些动态变化等, 需要制备其单克隆抗体(mAb 。但商品鸡I L 22很昂贵, 而且其免疫原性很弱, 用 常规免疫的方法很难制备抗鸡I L 22的mAb [3]。为此我们构建 并鉴定了鸡I L 22真核重组表达质粒, 为下一步用重组真核表达质粒免疫BALB /c小鼠研制针对鸡I L 22的基因工程mAb 奠定基础[4]。 1　材料和方法 1. 1　材料　鸡I L 22c DNA 为本实验室邵卫星博士惠赠, 其序 列与Gen Bank 中的AF017645及陈鸿岩等发表的序列完全相同[5]。真核表达载体pc DNA3. 1(+ 及增强型, 绿色荧光蛋白(EGFP 及C OS 细胞均由本实验室保存。B am H I 、T4连接酶、d NTP 及Taq DNA 聚合酶, 均购自Pomega 公司。Xba I 、 收稿日期:2004-07-19; 　修回日期:2004-10-29 基金项目:江苏省基础研究计划自然科学基金资助(No . B作者简介:提金凤(1977- , 女, 山东莱州人, 硕士生. Tel:(30514 7979376; Email:xiufan@yahoo . com Corres ponding author X ho I 及Sal I 购自华美公司。琼脂糖凝胶DNA 纯化试剂盒购 自宝生物工程(大连 有限公司。所有引物均由宝生物工程 (大连 有限公司合成。扩增I L 22基因的上游引物:5′2CCC GCC ATG ATG TGC AAA GT A CTG ATC 2 3′, (划线处为B am H I 酶切位点 , 下游引物:5′2CCC AAA AAA ATT ATT TTT GC A G AT AT C T CA C 23′, (划线处为Xba I 酶切位点 ; 扩增EGFP 基因的上游引物:5′2CCC ATG GTG AGC AAG GGC G AG G A 23′, (划线处为Sal I 酶切位 点 , 下游引物:5′2CCC T CT AG A GCT TT A CTT GT A CAG CT C GT 23′, (划线处为Xba I 酶切位点 。其中B a m H I 和Xba I 与pc DNA3. 1上相应的多克隆位点相吻合Sal I 与鸡I L 22基因片段中游的酶切位点相吻合, 上述引物均由宝生物工程(大连 有限公司合成。 1. 2　方法 1. 2. 1　鸡I L 22基因的PCR 扩增　以鸡I L 22cDNA (RT 2PCR 获得, 为线性DNA 为模板, 利用其特异性上、下游引物进行 PCR 扩增。反应参数为:94℃预变性5m in, 94℃40s, 52℃40s, 7