王镜岩_生物化学_经典课件_核酸化学.ppt

每延伸一个核苷酸需四步化学反应： (1) 脱三苯甲基：末端核苷酸的DMTr用三氯乙酸/二氯甲烷溶液脱去，游离出5′-OH 。 (2) 缩合：新生成的5′-OH 在四唑催化下与下一个核苷3′-磷酰亚胺单体缩合使链增长。 (3) 盖帽：有少量(小于0.5%)未缩合的5′-OH 要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。 (4) 氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷。上述步骤循环一次，核苷酸链向5′方向延伸一个核苷酸。 基本要求 1.掌握核酸的分离、提纯、定量测定、超速离心和凝胶电泳等基本方法。（重点） 2.熟悉核苷酸序列测定的原理。（难点） 3.熟悉DNA聚合酶链反应的原理及应用。（难点） 4.熟悉DNA化学合成的原理及应用。（难点） 知识回顾Knowledge Review 大部分限制性内切酶识别的碱基序列为4~ 6 个碱基的palindrome 顺序。它们在微生物细胞内发挥iu的是防御外来DNA入侵的国防军的作用。 碱基 adenine 4.15, 9.8 cytosine 4.5, 12.2 guanine 3.2, 9.6 thymine 9.9, 13 核苷 adenosine 3.5, 12.5 deoxyadenosine 3.8 cytidine 4.15, 12.5 deoxycytidine 4.3, 13 guanosine 1.6, 9.2 deoxyguanosine 2.5 uridine 9.2, 12.5 deoxythymidine 9.8, 13 核苷酸 AMP 3.7, 6.1 : dAMP 4.4 ADP 3.9, 6.3 : --------- CMP 4.5, 6.3 : dCMP 4.6 GMP 2.4, 6.1, 9.4 : dGMP 2.9, 9.7 UMP 6.4, 9.5 : dTMP 10.0 二、核酸的酸碱性质 碱基配对时碱基一般以酮式存在，而不是醇烯式。 碱基中的H原子一般不移动，因此很少有亚氨基团。 在中性pH条件下，参与氢键的-NH2基均不带电荷，这是杂环电子共轭以及氢键共同作用的结果，否则双螺旋结构不会稳定。 碱基、核苷、核苷酸的pK值 三、核酸的紫外吸收 1 OD260 DS DNA 50 ?g SS DNA 37 ?g RNA 40 ?g DNA分子的变性 四、核酸的变性，复性及杂交 变性和复性的含义 DNA的变性在紫外吸收上的变化 Tm的定义 影响Tm的因素 1.DNA 的均一性越高,Tm的温度范围越小。 2.G-C含量越高, Tm的值越大，当GC的含量上升1%，则Tm上升0.4℃。马默多蒂（Marmur-Doty）关系式： Tm = 69.3+0.41(G+C)%， 或GC%=（Tm-69.3）×2.44 3.介质的离子强度较高时, Tm的值较大。 4.酸性条件下,核酸容易脱嘌呤,碱性条件下,核酸容易变性,通常加NaOH 降低Tm的值。 5.尿素,甲酰胺等化学试剂可以降低Tm的值,称作变性剂。 SSC溶液，常用于DNA的溶解。 (二) 复性 T1/2 × C ＝ const DNA浓度与复性时间的关系 影响复性速度的因素 1.DNA的片段越大,复性的速度越慢; 2.DNA的浓度越高,复性的速度越快; 3.DNA的重复序列越多,复性的速度越快; 4.溶液的pH过高或过低,复性的速度均会降低; 5.适当增高溶液的离子强度,复性的速度会增高。 DNA复性与Cot分析 当 C/C0=1/2时， k=1/C0t1/2 哺乳动物的DNA 一般均呈右图的曲线，这是因为它们的基因组DNA 中插入了大量的重复序列，如人的DNA中就插入了长度为350bp的Alu序列达50万份拷贝之多。 人DNA的Cot曲线 (三) DNA的分子杂交技术 分子杂交是将不同来源的核酸分子分别变性，再混合后复性，使不同来源的单链的互补区形成双链的技术。 通常将其中的一方用放射性同位素或特定的基团(如生物素,地高辛)标记，称作探针，现时的探针多为人工合成的短片段。 若将杂交的另一方直接点到膜上进行杂交，称作点