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第四章 核酸分子杂交技术 (nucleic acid hybridization) 一、 核酸分子杂交的基本原理 （一）核酸杂交的基本理论 ——DNA的变性与复性 1、DNA变性: 是指在某些理化因素的作用下， DNA双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链的过程。 常用的变性方法：加热 检测DNA变性方法：260nm紫外吸收值 DNA变性后， 260nm紫外吸收值增加。 2、DNA复性(renaturation) 指变性DNA在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的过程。 热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为退火(annealing) DNA复性后， 260nm紫外吸收值降低 （二）核酸分子杂交 (hybridization) 含义：是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。 杂交的双方分别称为探针与待测核酸，杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。 核酸分子杂交的3种形式 DNA-DNA之间； RNA-RNA之间； DNA-RNA之间。 核酸分子杂交技术是目前生命科学研究领域中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异DNA或RNA序列片段的有力工具 第二节 核酸探针及其标记 探针(probe)： 指是指带有某些标记物、能与特定的靶分子(DNA或RNA)发生特异性结合的核酸分子。 探针技术的目的： 利用杂交实验，用探针（probe）与靶DNA/RNA杂交，以鉴定靶DNA/RNA中的特异核苷酸序列。 制备特异性探针需要具备下列条件之一： 1）被检基因结构清楚； 2）有明确的基因产物;3）已知某一基因产物对表型的反应或缺少某一基因对表型的反应。 一、核酸探针的种类 根据其性质、检测目的不同可以分为4种： DNA探针、RNA探针、 cDNA探针、寡核苷酸探针 二、探针的标记 （一）标记物 1、核素标记物。如：32P，3H，35S 等。 2、非核素标记物。如：生物素、地高辛、荧光素等 （二）标记方法 缺口平移法 （Nick Translation） 原理： 1）DNAase I在探针DNA打开缺口 2）DNApol-I在缺口处按5’→3’方向切除单核苷酸 3） DNApol-I的5’→3’聚合：在缺口3’端随机掺入dNTP与32P-dNTP ，探针即被标记 随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。 实质：用[α-32P]dNTP取代原来DNA链中不带同位素的同种核苷酸，生成的两条链均被同位素标记 2、随机引物法（random priming） 原理： 人工合成的6~8个核苷酸长的不同引物，可随机地与DNA探针互补作为引物， 在E.coli DNA pol-I的Klenow片段5’→3’聚合作用下，合成与探针DNA互补的长短不等的DNA探针。 随机引物标记探针 第三节 核酸分子杂交的基本方法 1、基本类型：3种 Southern印迹杂交(Southern blot)，检测DNA； Northern印迹杂交(Northern blot)，检测RNA； Western 印迹法（免疫印迹） ，检测蛋白质。 印迹(blot)技术：是将存在于电泳凝胶中的生物大分子转移（印迹）于固化介质上并加以检测分析的技术。 2、由Southern印迹衍化出的方法，如： 斑点杂交、原位杂交、液相杂交等。 Northern 印迹杂交： 检测RNA（主要是mRNA） 与Southern杂交的不同点： 靶核酸：RNA；转膜：不需变性 Northern blot 检测RNA（主要是mRNA） 原理及步骤：提取T、Cell 总 RNA ↓ 提纯分离mRNA ↓ 琼脂糖凝胶电泳分离RNA ↓ 转移至硝酸纤维素膜 ↓