新甲胎蛋白测定.pptVIP

甲胎蛋白测定(酶联免疫法) 实 验 目 标： 1.掌握ELISA法测定AFP的原理及注意事项 2.熟练地进行AFP测定 3.了解AFP测定的主要临床意义 实验原理：本试剂盒在微孔板条上包被纯化抗-AFP,配以酶标记抗体(抗-AFP-HRP)及TMB等其它试剂,利用ELISA双抗夹心法原理检测人血清中AFP含量。 操作步骤:1、配制洗涤液：用500ML蒸馏水或去离子水将洗涤液稀释至备用。 2、加样：将包被孔编号，留1孔作空白对照，其余孔用微量加样器依次加入标准（分别是标准A和标准B,共六种）及待测样品各50μl。 3、加酶结合物：每孔加入酶结合物50 μ l（1滴），空白孔不加。轻轻振荡混匀，用封板膜将板孔封好。 4、温育：置37℃温育30min。 5、洗涤：甩去孔内液体，在各孔内注满洗涤液，静置20秒，甩干，反复5次后在吸干纸上拍干。 6、显色：每孔加入底物液A、B各50μl，充分混匀，室温避光显色5min。 结果判定： 1、AFP标准品浓度分别为:10、20、50、100、200、400ng/ml 2、目测：在白色背景下观察各孔着色， 蓝色浅于或等于A、B标准品，判为阴性。 蓝色深于或等于C标准品，判为阳性。 临床意义 AFP是原发性肝癌的最灵敏、最特异的肿瘤标志物，80%以上的原发性肝癌患者血清AFP明显增高，AFP检测诊断肝癌的标准为：①血清AFP测定结果大于500μg/L持续4周；②AFP含量有不断增高者；③血清AFP测定结果大于200μg/L持续8周。 在畸形妊娠时（无脑儿、脊柱裂）时,孕妇血清AFP异常升高. 注意事项： 1、试剂及待测样本用前先放室温平衡30分钟。 2、含血球的标本易出现假阳性。 3、洗涤要彻底，防止假阳性，但不可洗涤过猛过急，而致假阴性。 4、滴加试剂前，应将滴瓶翻转数次混匀，滴加时瓶身应保持直并匀速加样。 ALP碱性磷酸酶测定 实验原理：在碱性条件下磷酸苯二钠被ALP分解成苯酚和磷酸根，4-氨基安替比林和高铁氰化钾与苯酚生成红色的醌型化合物，在510纳米波长测定吸光度值，计算活性。 实验准备： 工作试剂制备：干粉用10ML蒸馏水溶解。 应用标准液配制：将浓缩标准液和蒸馏水按1：9体积充分混合，浓度为100U/L。 测定方法： 试剂空白 标准管 测定管 工作试剂ML 1 1 1 应用标准液 — 0.05 _ 样品 _ _ 0.05 充分混合,37℃水浴15分钟 显色剂 1 1 1 充分混合,37℃水浴3分钟,在510纳米波长下测定结果. 计算及参考值 ALP(U/L) = AU / AS × 100 参考值:成人24~92U/L, 儿童35~140U/L. 临床意义: 血清ALP活力测定常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊断指标.