基因结构和功能剖析.pptVIP

核糖核酸酶保护实验(Ribonuclease protection assay，RPA)是近十年发展起来的一种全新的mrna定量分析方法。其基本原理是将标记的特异RNA探针(32P或生物素)与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合，形成双链RNA;未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待测目的基因与特异RNA探针结合后形成双链RNA，免受RNA酶的消化，故该方法命名为RNA酶保护实验。对于32P标记的探针，杂交双链进行变性聚丙酰胺凝胶电泳，用放射自显影或磷屏成像系统检测被保护的探针的信号; 对于生物素标记的探针，杂交双链经过变性聚丙酰胺凝胶电泳后电转移至尼龙膜，采用链霉亲和素-辣根过氧化物酶(Streptavidin-HRP)和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合，X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。 焦磷酸测序的原理： 一条特异性测序引物与单链模板退火后，加入酶混合物和底物混合物，其中酶混合物包括DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶；底物混合物包括5‘-磷酸化硫酸腺苷APS和虫荧光素。 向反应体系中加入一种dNTP，如果他和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’-末端，同时释放出一份子的焦磷酸PPi。 在三磷酸腺苷双磷酸酶的作用