十二转基因生物反应器.ppt

第12章 转基因生物反应器 12.1转基因生物反应器 一、转基因生物反应器（Transgenic bioreactor）：将外源基因转入细胞或动植物，利用细胞增殖或者动植物代谢制备外源基因的表达产物的技术。 转基因微生物生物反应器：由于微生物结构简单、繁殖迅速、容易培养而成为转基因对象，主要采用遗传背景清楚的大肠杆菌和酵母表达系统，通过高密度发酵培养、分离纯化获得所需要的目的产物，生产的药物属于第一代基因工程药物。 转基因植物细胞生物反应器：将外源基因转入植物细胞，表达制备相关产品。由于植物细胞大规模培养技术限制，目前利用转基因植物细胞大规模生产基因工程产品有一定难度。 转基因动物细胞生物反应器：将外源基因转入动物细胞，表达制备相关产品。利用转基因动物细胞生产蛋白类药物、疫苗、细胞因子等产品已经成为生物制药的热点。 转基因动植物生物反应器：将外源基因转入动植物个体，表达制备相关产品。转基因动植物技术不仅限于转基因技术，而且还涉及植物组织培养、动物胚胎工程等技术，因此过程复杂。 12.2 转基因动物细胞生物反应器 大多数哺乳动物蛋白翻译后的修饰，例如：糖基化、磷酸化和乙酰化等，是保持生物学活性、稳定性及抗原性的前提 例子：tPA 第一个哺乳动物细胞表达生产的医用蛋白,是溶血栓药物组织型纤维酶原激活剂（Tissue plasminogenactivator，tPA）。 促红细胞生成素 人体中的促红细胞生成素是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样物质，为分子量6～7万的糖蛋白。 药用价值：能够促进红细胞生成。服用红细胞生成素可以使患肾病贫血的病人增加血流比溶度（即增加血液中红细胞百分比）。 中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达制备促红细胞生成素（erythropoietin,EPO） 12.3转基因动物 (P259) 一、概念与发展历史 转基因动物：是指在基因组内稳定地整合以实验方法导入的外源基因，并且可以稳定地遗传给后代的遗传工程动物。 发展历史: 1974年，Jaenish等应用显微注射法，在世界上首次获得AV40DNA转基因小鼠 1980年，Gordon等人育成带有人胸苷激酶的转基因小鼠 1983年，Palmiter等人将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵中 获得“硕鼠”随后的十几年时间里，转基因的兔、绵羊、猪、牛、山羊、鱼、鸡陆续育成。 二、转基因动物的制备 (一)原理方法 1、基本原理 转基因动物培育的基本原理是借助分子生物学和胚胎工程的技术，将外源目的基因在体外扩增和加工，再导入动物的早期胚胎细胞/受精卵/卵细胞中，使其整合到染色体上，当胚胎被移植到代孕动物的输卵管或子宫中后，发育成携带有外源基因的转基因动物。 2、转基因动物的技术（方法） 培育转基因动物的关键技术包括：外源目的基因的制备，外源目的基因的有效导入，胚胎培养与移植，外源目的基因表达的检测等。 核心技术是如何成功地把目的基因转入 1）目的基因的制备(分为二步) 第一步：目的基因的获得 第二步：目的基因的克隆 2）目的基因的导入(核心技术) （1）原核期胚胎基因显微注射法：通过显微操作仪将外源基因直接注入受精卵 基本步骤 目的基因的制备与纯化 卵供体动物和假孕动物的准备 超排卵、受精与取卵 基因显微注射:将纯化的目的基因注射到受精卵的雄性原核内 受精卵移植 目的基因的表达整合鉴定和检测 特点：用显微注射方法制备转基因动物，操作技术性很强，即使是受过严格训练的专业人员，发育成转基因动物的受精卵也只占注射卵的5%； 　导致基因组的重排、易位、缺失等。 （2）胚胎干细胞移植法：将正确整合的转基因ES细胞培养后进行核移植或注射到处于胚泡期的供体胚胎，将胚胎移植到代母的子宫内。 特点：转基因的效率高 　　　可能得到嵌合体 （4）精子载体导入法： 这一方法的独特步骤包括： ①外源目的基因导入精子：可通过DNA与精子共育法、电穿孔导入法、脂质体转染法等方法实现。 ②被导入外源目的基因的精子与卵子受精。方法有人工授精、壶腹部手术授精、体外授精等，最终获得转基因动物。 特点：经济、方便、转染率高 （4）反转录病毒感染法：将含目的基因的反转录病毒载体人为感染早期胚胎细胞实现基因转移，产生转基因动物。 特点：基因转移效率、感染率、整合率明显高于其他基因转移方法。 　但不能完全杜绝反转录病毒在转基因动物生产的商品中的污染。 （5）卵母细胞显微注射法 基本方法：将带有外源目的基因的反转录病毒通过显微注射技术注入卵母细胞的卵周腔，通过体外受精，胚胎移植获得转基因动物。 优点（262） 　　　　适合制备大型转基因动物 　对卵的机械损伤小 　提高外源基因与核染色体接触的机会 　提高外源基因的整合率 （6）转基因克隆动