病毒鉴定的方法.ppt

病毒鉴定的方法 病毒的检测手段和方法在不断发展和改进，但无论是什么样的方法，病毒所共有的两个特性而发展起来的： 一是病毒的侵染性。 二是病毒作为核蛋白的特性，也就是病毒理化性质。 病毒鉴定的方法： 1、电子显微镜检测法 2、电镜复染检测法 3、免疫电镜检测法 4、血清学检测法 5、酶标免疫吸附法 6、基因检测技术 7、蛋白指纹图谱 1、电子显微镜检测法 电子显微镜技术是最直接，最准确的检测病毒的手段，它可以直接看到病毒的形态结构、存在与否，所以在进入了分子水平的今天它仍然有着不可替代的作用。 原理：电子显微镜以电磁波为光源, 将感病植物组织制成检测样本, 利用短波电子流, 在电子显微镜下观察, 可根据病毒的形态、大小、内含体以及染病组织超微结构等诊断病毒的种类。 返回 2、电镜负染检测法 电镜负染技术是20世纪60年代开始使用于英国试验室，其图像如同一张照相的底片，因此人们习惯地称为负染色，电镜负染技术也就由此而生。 原理：一些重金属离子能绕核蛋白体四周沉淀下来，形成一个黑暗的背景，在核蛋白体内部不能沉积而形成一个清晰的亮区，由此辨别病毒。 返回 3、免疫电镜检测法 免疫电镜技术是将免疫学原理与电镜负染技术相结合的产物，在电镜制样过程中，于铜网上先铺展一层细胞色素A，稍后再添加一滴抗体，多余液滴用滤纸吸掉，最后点上一滴抗原和染液，由于细胞色素A的作用，减少了样品即抗体、抗原的表面能力，能形成均匀的涂层。 原理：在电镜制样过程中，病毒颗粒不能集中的沉积在有效的电镜视野内，而容易造成电镜观察时的疏漏，免疫电镜法利用了抗体、抗原的亲和性与吸附性的这一特点，使病毒能较集中地沉集在有效视野内，从而便于电镜下的观察，提高了检测几率。 返回 4、血清学检测法 动物受其致病细菌、病毒侵染后，动物体内血液中的球蛋白发生变化而产生抗体，引起动物产生抗体的物质简称为抗血清。由于不同病毒产生的抗血清都有各自的特性, 因此可以用已知病毒的抗血清来鉴定病毒种类。 原理：病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白是一种很好的抗原, 血清中的抗体能与同系的抗原在体外特异的结合，使抗原失去活力。 返回 5、酶标免疫吸附法 该方法最早用于动物病毒的检测，近二三十年才应用于植物病毒的检测，并作为病毒的定量方法广泛应用于病理、免疫学的研究和生产实践中，对病毒进行快速检测。此法的最大优点是灵敏度高，很多的病毒因其浓度太低或某种抑制剂的干扰，常规血清学方法检测不出时，此法就显示出独特的优越性。 原理：将同源特异抗体吸附在反应器皿底部，加入欲测试的含病毒的样品，病毒与抗体结合，病毒颗粒被固定，再加入酶标记的特异抗体和酶的底物，酶与底物反应后会出现有颜色的溶液其强度与病毒浓度成正比，用此方法可测定出病毒的浓度。 返回 6、基因检测技术 基因检测技术对病毒的检测已经达到分子水平，其灵敏度和特异性是任何生化方法的检测所不能比拟的，同时可以省略大量的病毒提纯和血清的制备工作。 原理:（1）分子探针杂交检测技术，利用一定序列的核苷酸合成探针，通过分子杂交技术，检测出供试样品中与之相补的碱基序列。 （2）PCR技术是通过体外扩增可以使供试样品中的目的基因片段很快扩增，使之达到了对即使是病毒含量极低的样品，也能灵敏准确地得到定性的结果。 返回 PCR技术： 原理：PCR技术是一种在体外将特异性DNA序列进行高效扩增的方法。PCR扩增DNA片断的特异性是由两个人工合成的寡核昔酸引物的顺序决定的,引物位于靶DNA的两侧,并分别和相对DNA链互补。 步骤:①将待扩增标本(靶DNA)在高温下变性, 双链解离;②降低温度,使两引物结合到靶D NA上,两个引物与靶DNA解链后的正负链互补;③在合适温度条件下,在DNA多聚酶的催化下,引物引导DNA合成。 PCR技术： 运用：A、用于遗传性疾病，如镰状红细胞贫血的诊断； B、用于艾滋病的检测：目前艾滋病的诊断主要采用血清学方法检查抗体,用PCR技术可在HIV感染早期血清未出现抗体之前于血清中测得HIV-DNA,也可从病人外周血白细咆中测得极微量HIV-DNA。 C、用于乙型肝炎的检测； D、用于轮状病毒的检测: 轮状病毒为婴幼儿急性病毒性胃肠炎的主要病原,PCR用于检测粪便中的轮状病毒比核酸杂交法, 敏感性提高5000倍。 返回 7、蛋白指纹图谱法 原理：不同病毒蛋白通过一维sDs一PAG