第10章基因工程的操作过程.pptVIP

第十章 基因工程的操作过程 2、Zeo选择系统 Zeo是编码博来霉素抗性产物的基因。 博来霉素（ bleomycin）是一种广谱抗肿瘤药。 （三）酵母其他显性标记基因 1、蓝白筛选基因：LacZ’基因 2、铜离子抗性蛋白基因：CUP1基因。编码一种铜离子螯合蛋白，适合铜离子敏感菌（如酿酒酵母）的筛选。 3、赭石突变抑制基因：sup4 利用赭石突变抑制基因 sup4筛选重组酵母菌 酵母菌AB1380（与 YAC 载体配套）的胸腺嘧啶合成酶基因带有一个赭石突变 ade 2-1，使其在基本培养基上形成红色菌落，但在缺少某种营养素的选择培养基上不能生长。 当带有赭石突变抑制基因 sup4 的空载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1基因的突变效应，该酵母菌在选择培养基上形成正常的白色菌落； sup4被外源基因插入失活后重组子呈红色。 YAC 载体带有trp 1、 leu 2和 his 3、 ura3 以及 sup4 密码子改变成UAA的无义突变又叫赭石突变 三、重组子的鉴定 核酸分子杂交法 裂解细菌电泳鉴定分子大小 限制性内切酶法 PCR法 基因产物检测法 序列分析 （一） 核酸分子杂交筛选法 1、Southern印迹杂交： 用标记的核酸探针检测目的基因存在与否 步骤： 1、用内切酶消化重组子 2、凝胶电泳分离 3、印迹到硝酸纤维素膜上 4、用标记的DNA探针杂交，若有带显示，说明其来源细胞为阳性重组体。 Southern印迹杂交 （1）原位杂交筛选 对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。 （2）R-环检测法 DNA-RNA杂交。用外源基因的mRNA与重组载体杂交。电镜下可见一种R-环形结构。 用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。 主要检测插入片断是否被转录。 2. Northern blotting （ Northern 杂交） （二）电泳筛选重组子 是从初筛的转化子中进一步筛出重组子的方法。 依据：重组载体与空载体DNA大小不同，在同一电场的迁移率也不同 适用于插入片段较大的重组子筛选 （重组子与载体电泳迁移率差别较明显） 电泳鉴定分子大小法筛选重组子的步骤 （三）限制性内切酶法 原理：外源片段通过特定的酶切位点插入到载体上，因此，可以用这些限制性酶切割提取的质粒DNA，电泳分析插入片段。 用途： 1、区分期望重组子和非期望重组子 2、判断插入的DNA分子质量 3、判断平末端连接的插入方向 （四）PCR法 原理：根据插入DNA片段设计特异性引物，以小量抽提的转化子DNA为模板，进行PCR反应，能扩增出特异片段的转化子为携有目的基因的重组子。 应用： 1、鉴定重组子 2、鉴定插入片断方向 PCR引物设计示意图 引物仅与载体上外源基因两侧序列或外源基因序列互补时，只能判断插入片段有无及大小而不能判断插入片段方向； 引物与载体上外源基因两侧序列及部分外源基因序列同时互补时，既可检测插入片段有无及大小，又可检测插入方向。 （五）蛋白表达检测法 SDSWestern Blot ELISA 1、SDS原理：根据对表达蛋白的大小的了解，电泳后考马氏亮兰染色观察有无期望带出现 应用：初步检测表达量比较高的蛋白（1mg/L） 方法：制备重组细胞和非重组细胞的蛋白粗提液，聚丙烯酰胺凝胶电泳后用考马氏亮蓝染色；对比电泳结果，判断有无外源蛋白表达。 （聚丙烯酰胺凝胶电泳） SDS、 Western Blot（ 免疫印迹法） 又称蛋白质免疫印迹（immunoblotting） 原理：先通过SDS使蛋白分开，然后转移到硝酸纤维素（NC）膜或聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，用标记的抗体与之反应，若有特异条代出现则可表明有特异蛋白表达。 显色多用碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶。 应用： 初步鉴定蛋白表达产物的正确性。 免疫印迹法操作步骤 一抗：多抗，能够识别变性目的蛋白的线性表位 二抗：抗一抗来源动物IgG的抗体 酶标底物显色至膜上； 化学发光底物显色到胶片上； 放射同位素使感光底片显色 蛋白由胶转移至NC膜或PCDF膜上 Western Blot 结果 3、ELISA 检测表达蛋白（酶联免疫吸附） 反应模式：Ab-Ag-Ab-酶标抗体 ①抗体包被反应孔； ②表达蛋白与抗体反应； ③酶标抗体反应； ④酶底物显色。 显色常用碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶。 1）双抗生素抗性标记的筛选方法 载体携带两个抗生素抗性基因，外源基因插入其中一个基因内导致其失活，用两种抗生素平板筛选重组子。 第一步：正选择。在不进行插