第四章 基因工程.pptVIP

一、基因工程的理论基础 基因工程概念 DNA分子的切割技术 DNA分子的切割技术 DNA分子的切割技术 DNA分子的切割技术 DNA分子的切割技术 限制酶所识别的序列有什么特点？ DNA分子的切割技术 用同一种限制酶处理不同DNA片段，会形成同样的黏性末端，可进行重组。 限制酶在原核生物中的作用是什么？ 存在：主要存在于细菌中。 特性：是很小的环状DNA分子，在细胞内能够自我复制。 作为运载体的条件 （1）必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到运载体上去。 （2）必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。 （3）必需带有标记基因，以便重组后进行重组DNA分子的辨认和筛选。 （4）必需是安全的，不会对受体细胞有害，也就是能够安全地“借居”在受体细胞中。 一、目的基因的获取 利用PCR技术扩增目的基因 PCR的全称： 聚合酶链式反应 PCR的原理： DNA复制 PCR技术扩增目的基因的前提条件： 要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。 启动子的作用： 三、目的基因导入受体细胞 1、什么是转化？ 2、目的基因导入植物细胞常用的方法是什么？具体过程是怎样的？ 3、目的基因导入动物细胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎样的？ 4、目的基因导入大肠杆菌的方法是怎样的？钙离子有什么作用？ 三、目的基因导入受体细胞 三、目的基因导入受体细胞 三、目的基因导入受体细胞 三、目的基因导入受体细胞 三、目的基因导入受体细胞 四、目的基因的检测与鉴定 1、导入目的基因后需要检测哪些方面？各采取什么方法？ 2、什么是DNA分子探针？检测时的DNA探针通过什么原理来检测目的基因和相应的mRNA？ 3、利用抗体－抗原杂交检测的原理是什么？ 四、目的基因的检测与鉴定 四、目的基因的检测与鉴定 四、目的基因的检测与鉴定 四、目的基因的检测与鉴定 1、目的基因的获取 根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 mRNA 单链DNA 双链DNA 逆转录 用化学方法直接人工合成 上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？ 优点 缺点 鸟枪法 反转录法 根据已知氨基酸合成DNA法 操作简便广泛使用 工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因 专一性强 操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高 专一性最强 仅限于合成核苷酸对较少的简单基因 条件：_______________________、 _______________、___________ (做启动子)、 ___________. 方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循 环的次数） 结果： 已知基因的核苷酸序列 四种脱氧核苷酸 一对引物 DNA聚合酶 指数 2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 利用PCR技术扩增目的基因 PCR技术扩增 a、DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板 在热作用下，_____断裂，形成___________ b、退火（复性25℃-65℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从 引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补 的________。 氢键 单链DNA 双链 DNA链 二、基因表达载体的构建—核心 用切目的基因相同的限制性内切酶切割质粒 二、基因表达载体的构建—核心 二、基因表达载体的构建—核心 目的基因 二、基因表达载体的构建—核心 1、基因表达载体的组成 目的基因 启动子: 终止子: 标记基因等 一段有特殊结构的DNA片段。位于基因的首端。 一段有特殊结构的DNA片段。位于基因的尾端。 二、基因表达载体的构建—核心 终止子作用： 使转录在所需要的地方停止。 标记基因作用： 是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基 因，从而将有目的基因的细胞筛选出来，如青霉素基因。 是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能 驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。 二、基因表达载体的构建—核心 2、基因表达载体的构建目的： a.使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。 b.使目的基因能够表达和发挥作用。 转 化 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 常用的方法: 农杆菌转化法、花粉管通道法、氯化钙法、基因枪法、显