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实验五 冰冻切片法 冰冻切片法简介 冰冻切片法是一种在低温条件下使已固定或新鲜组织块不经脱水和包埋先进行冰冻快速冷却到一定硬度，然后在切片机上切片的一种方法。 冰冻切片的优缺点 优点： 简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节。 快速，用时短。 组织变化不大。 能很好保存脂肪，类脂等成分。 能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。 缺点： 不容易做连续切片。 切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。 不容易制作较薄的切片。 组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。 冰冻切片的适用范围 在手术进行中，突然发现病人的病变与原诊断，原定手术方案不相符合，或者怀疑时，需要病理确定。 了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗措施。 在做剖腹探查时所发现的肿块或者异样的组织。 显示组织中的脂肪和脂类物质，这常见于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研组织等。 某些酶的显示如ATP酶，琥珀酸脱氢酶等。 神经病理学技术中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。 对某些物质所进行的免疫荧光的研究。 冰冻切片的种类 冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法、二氧化碳冰冻切片法、甲醇循环制冷冰冻切片法、半导体冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。 半导体冰冻切片机构造 半导体制冷器 冷台 冷刀 制冷调节器 切片机 一、实验目的 了解半导体冰冻切片机的基本构造； 练习半导体冰冻切片法制片。 二、实验材料及用品 实验材料：小鼠肝脏 实验用具：载、盖玻片；显微镜；毛笔；半导体冰冻制冷器、切片机等。 实验药品：甘油明胶液。 三、实验步骤 取材：引颈致死法杀死小鼠，取其肝脏，将新鲜肝脏组织切成1~1.5cm×1~1.5cm X 0.3~0.5cm大小。组织块可不加任何处理，直接进行冰冻切片。另一种方法是组织先经10％中性福马林或钙福马林固定，再水洗后冰冻切片。若组织用酒精固定，则固定后须用流水彻底除去组织内的酒精，否则因酒精冰点低，不易冰冻。 切片机连接：半导体冰冻切片机的水路和电路按使用说明书要求接好。水流的次序为：自来水龙头→冷台进水→冷台出水→冷刀进水→冷刀出水→下水。致冷器工作时，应始终保持水流畅通，要牢牢记住，先通水，后通电；先关电源，后关水，否则将烧坏机器。必须保证一定的流水量：400ml/min 将新鲜材料置于冷台上冰冻组织，组织块冻结的硬度与切片的成败有密切关系，如切削后在刀片上出现白色而脆的飞散碎片，即组织块冻结太硬；若为软弱的粥状则太软，只有适当硬度切出的切片才能平展成形。这要根据工作经验，控制适当的致冷温度。 切片：切片厚度一般为10-15um。切下来的切片用湿毛笔从刀上挑起，置于清水中使其展开，或直接粘于破片上。 封片：由于切片染色后不再经过脱水、透明等步骤，因此必须使用水溶性的封片剂，如甘油明胶液， 注意事项 速冻是冰冻切片的关键，冷冻的速度可有效的减少冰晶的出现，软组织以及细胞丰富的组织如肝、脾、淋巴结等2-4min； 冰冻切片的温度要适宜，温度过低、过高会导致组织过硬或硬度不够，从而影响切片质量，产生搓板状、梯田状、厚薄不均，破碎或粉末状现象。根据器官组织形态结构和组成成分的不同，冰冻组织切片的温度亦不同。推荐：乳腺、卵巢、子宫等：-20~-25℃ 胃肠：-18~-20℃-甲状腺、肝，肾、脾等：-15℃左右·脂肪组织一般在-35℃以下； 封片时要做到无气泡，无溢液、标签清楚端正，保证切片的整洁。 四、实验结果 观察小鼠肝脏细胞的形态 五、作业 实验完毕，每人交制好的玻片标本1片，在标签纸写上玻片名称及自己的姓名和日期； 实验报告（姓名和日期）。 知识回顾Knowledge Review