蛋白质与酶工程第三章酶的分离纯化.ppt

超临界流体萃取的应用 医药工业 化学工业 食品工业 化妆品香料 中草药提取 酶，纤维素精制 金属离子萃取 烃类分离 共沸物分离 高分子化合物分离 植物油脂萃取 酒花萃取 植物色素提取 天然香料萃取 化妆品原料提取精制 根据分离方法不同分为： 1等压分离 2等温分离 3吸附分离 改变压力的超临界萃取流程 原料 萃取相 溶剂 萃取产物 萃余相 萃取器 分离器 减压阀 压缩机 P1 T1 T2 P2 等温法 T1＝T2，P1＞P2 （1）等温变压流程 改变温度的超临界萃取流程 等压法 T1T2，P1=P2 加热器 原料 萃取相 溶剂 萃取产物 萃余相 萃取器 分离器 阀门 泵 冷却器 T1 T2 P1 P2 （2）等压变温流程 采用吸附分离的超临界萃取流程 阀门 原料 萃取相 溶剂 吸附剂 萃余相 萃取器 吸附器 泵 （3）等温等压吸附流程 吸附法 T1=T2，P1=P2 反胶束萃取 定义：利用反胶束将酶或蛋白质从混合溶液萃取出来的一种分离纯化技术。 反胶束又称反胶团，是表面活性剂分散于连续有机相中形成的纳米尺度的一种集体。反胶束是透明的，热力学稳定的系统。 胶束和反胶束结构示意图 3.5 酶的组合分离纯化策略 Resolution（分辨率） Speed（速度） Capacity（容量） Recovery（回收率） 设计分离纯化工艺的基本要求 本章 目录 3.6 酶的浓缩、干燥与结晶 浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。 离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。 蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不稳定，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用真空浓缩。即在一定的真空条件下，使酶液在60℃以下进行浓缩。 在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须进行干燥。常用的干燥方法有： 真空干燥 冷冻干燥 喷雾干燥 气流干燥 吸附干燥 结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶的结晶是酶分离纯化的一种手段。它不仅为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。 酶在结晶之前，酶液必须经过纯化达到一定的纯度。如果酶液纯度太低，不能进行结晶。通常酶的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。总的趋势是酶的纯度越高，越容易进行结晶。 要说明的是，不同的酶对结晶时的纯度要求不同。 有些酶在纯度达到50%时就可能结晶，而有些酶在纯度很高的条件下也无法析出结晶。所以酶的结晶并非达到绝对纯化，只是达到相当的纯度而已。 盐析结晶 有机溶剂结晶 透析平衡结晶 等电点结晶 本章 目录 不饱和溶液 饱和溶液 过饱和溶液 析出沉淀（快） 析出结晶（慢） （无排列排队机会） 结晶“三步曲” 第一步：形成过饱和溶液——稍微越过饱和状态，处于介稳 态， 浓缩、降温（少有升温）、调节pH至pI，可使溶 液趋于过饱和。 第二步：形成晶核——过饱和溶液在一定条件下可形成极微小 的有序排列的固相物，成为后续晶体生长的核心，称 为晶核。振荡、搅拌、快速降温可促使过饱和溶液形 成晶核，有时可投入少量“晶种”微粒。 第三步：晶体生长——溶质在晶核周边不断有序排列，晶体逐 步长大。控制条件，如缓慢搅拌、适当升温使细小晶 体溶解，溶质到大晶体周围集结生长。 结晶条件 （1）酶的纯度——一般酶纯度应达到50%以上。 （2）酶蛋白的浓度——对大多数酶来说，蛋白质浓度在 3~50mg/mL 较好。 （3）晶种——有些不易结晶的酶，需加入微量的晶种才能形 成结晶。 （4）温度—— 一般控制在0~4℃范围内。 （5）pH值——一般选择在被结晶酶的pI值附近。 凝胶电泳 1、聚丙烯酰胺凝胶（PAG） PAG由丙烯酰胺（ arc，单体）和甲叉双丙烯酰胺（ bis，双体，交联剂）在催化剂作用下聚合而成。 arc浓度：凝胶的孔径大小 arc和bis的比例：凝胶的强度 催化剂用量：聚合时间 一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 2、PAGE的应用类型 常规PAGE 浓度梯度PAGE SDS不连续PAGE（用于一般分析分离纯化） 连续PAGE（同上）