生物化学中蛋白质.ppt

蛋白质浓度高时可用紫外线直接观察 (1) 电泳后取出胶体 (3) 胶片两侧各切出一条胶体 (2) 目标蛋白质可能位置？ (4) 进行染色或 活性测定 (5) 比对原 胶体兩 侧位置 后切出 目标蛋白质 ++ 9 7 5 3 - 0 Ampholyte + 聚焦在pI 在低 pH 处带正电被排斥 - + 在高 pH 处带负电被排斥 - - *等电聚焦电泳（IEF） ■ 双向电 泳 100 50 25 7 5 6 4 Isoelectric Point kD SDS PAGE pH （四）层析 层析(chromatography)分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。 蛋白质分离常用的层析方法 * 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 * 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。 离子交换层析 载 体 + + + + + + + + + + + + + + + + 样品分子 流动相 固定相 阳离子基团 Counter ion 阴离子 + （五）超速离心 超速离心法(ultracentrifugation) 在重力作用下，Pr在溶液中逐渐沉降，直至其浮力与离心所产生的力相等，此时沉降结束。 既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。 *蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。 因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。 三、多肽链中氨基酸序列分析 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基 把肽链水解成片段，分别进行分析 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法 一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。 通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列 分离编码蛋白质的基因 测定DNA序列 排列出mRNA序列 蛋白質的等電點是決定其帶電性質的重要指標： 蛋白質的帶電性質決定於其環境的酸鹼度，當環境的 pH = 6 時，則某 pI = 5 的蛋白質將會帶負電，因為環境的 pH 高於其 pI。 這幾乎是蛋白質最重要的性質，將會影響其分子構形、酵素活性，以及很多實驗上的操作，如離子交換法、電泳、等電焦集法、鹽溶等。若環境的 pH = pI，則此蛋白質的淨電荷將為零，因為沒有來自相同電荷的斥力，此種蛋白質間將會互相凝聚起來，漸漸沈澱下來。 因此，有些蛋白質可以在其自身的等電點下沈澱，也是一種純化的方法；但須注意，也有些蛋白質在其 pI 下沈澱之後，就不容易再溶解回來，也會因此而損失；蔗糖合成脢就是如此。 摘要： 說明 表 2.1? 各種鹽析及沉澱法的比較： 最簡單的製備式電泳裝置，可以借用一般的電泳槽： 製備式電泳操作通常都不會有很大問題，但要注意酵素活性的保持，以及回收率可能會偏低。有些不穩定酵素，根本不適合進行製備式電泳，要先以少量樣本試試看。 市面上所推出的製備式電泳裝置很多，尤其是 Bio-Rad 一直在這方面有新產品研發。 製備式電泳直接把所要的蛋白質色帶切下來溶離： 有幾個方法可以檢定蛋白質的位置： (1) Coomassie Blue 染色法; (2) 活性染色; (3) UV 照射呈像。定位後要把含有目標酵素的膠體切出來，進行電泳溶離，以收獲酵素。 說明文字 二次元電泳可以分析極為複雜的樣本： 最近興起的蛋白質體研究，都想一下子把一個細胞的所有蛋白質全部分離開來，挑選其中有意義的色點，取出來直接進行分析其成分。因此，二次元電泳變得很重要，因為它的確可以達到分離的效果。通常第一次元都用等電焦集法，第二次元用 SDS。要把二次元電泳跑好比較困難，至少平常的電泳要跑得很好才行。 圖 3.6? 離子交換法原理： （一）肌红蛋白(Mb)与血红蛋白(Hb)结构 二、蛋白质空间结构与功能的关系 Hb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。 （二）血红蛋白的构象变化与结合氧 肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线 * 协同效应(cooperati