酶工程-第五章.pptVIP

第五章 酶的固定化 第一节 固定化方法 第二节 酶固定化的特性 第三节 固定化技术的应用 作业题 1、酶的固定化主要方法有哪些？ 2、什么是固定化酶？固定化后的酶的特性有哪些改变？ 3、什么是固定化细胞？固定化细胞有何应用？ 4、什么是固定化原生质体？固定化原生质体有何特点？ 一、固定化酶的应用 固定化酶既保持了酶的催化特点，又克服了游离酶的不足，具有以下特点： 酶的稳定性增加，减少了温度、pH、有机溶剂和其他外界因素对酶活力的影响，可以较长期地保持较高的酶活力。 固定化酶可反复使用或连续使用较长时间，提高了酶的利用价值，降低了生产成本。 固定化酶易于与反应产物分离纯化，提高了产品质量。 乙酰 -DL — Ala L — Ala +乙酸 乙酰 -D — Ala 世界上第一种工业化生产的固定化酶。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成DL-乙酰氨基酸，再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的60％左右。 1、固定化酶在工业中的应用 ⑴氨基酰化酶 Aminoacylase 氨 基 酰 化 酶 泵 储 罐 反应产物 离心机 消旋反应器 固定化酶柱子 晶体 L-Ala L-Ala A-D-Ala A-L-Ala A-D-Ala ⑵葡萄糖异构酶：高果糖浆的生产 世界上生产规模最大的一种固定化酶。将培养好的含葡萄糖异构酶的放线菌细胞用60～65℃热处理15min，该酶就固定在菌体上，制成固定化酶，催化葡萄糖异构化生成果糖，用于连续生产果葡糖浆。 ⑶青霉素酰化酶：转化流程图 2、固定酶在酶传感器方面的应用 酶传感器是由固定化酶与传感元件两部分组成的，其中酶是与适当的载体结合形成的不溶于水的固定化酶膜。 最常用的酶传感器是酶电极，即将固定化酶膜与转换电极做在一起，当酶膜与被测物发生催化反应而生成电极活性物质后，电极测定活性物质并将其转换为电信号输出。 酶电极 酶电极是由固定化酶与各种电极密切结合的传感装置。1962年Clark和Lyons提出模型，1967年Updike和Hicks首先制造出酶电极并把它用于葡萄糖的定量分析。 酶电极一般可根据电极检测物理量的不同分为电流型和电压型，前者一般有氧电极、H2O2电极等，后者有NH3、CO2、H2电极等。 较典型的一种酶电极为葡萄糖酶电极。 葡萄糖＋醌＋H2O 葡萄糖酸＋氢醌 葡萄糖氧化酶 氢醌 醌＋2H＋＋2e－ Pt 铂电极 葡萄糖酶电极结构示意图 葡萄糖酶电极的敏感膜是葡萄糖氧化酶（GOD），它被固定在聚乙烯酰胺凝胶上。 在酶膜的作用下葡萄糖发生氧化反应，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和过氧化氢。通过用电极测量被消耗的氧或生成的过氧化氢就可了解葡萄糖浓度。 脲电极 Urea + 2H2O 2NH4++2HCO3- 脲酶 产生的2NH4+为阳离子电极感应。 此外还有：氨基酸电极 醇电极 尿酸电极 乳酸电极 青霉素电极 亚硝酸离子电极：菠菜亚硝酸还原酶产生NH3 二、固定化细胞的应用 指通过各种将细胞与水不溶性载体上结合，制备固定化细胞的过程称为细胞固定化。 固定化细胞指固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动的细胞。 1、固定化微生物细胞的特点 ⑴保持了细胞的完整结构和天然状态，稳定性好； ⑵保持细胞原有酶系、辅酶体系和代谢调控体系； ⑶发酵稳定性好，可反复使用或连续使用； ⑷细胞密度提高，可增加产率； ⑸提高固定化工程菌的质粒稳定性。 2、固定化微生物细胞的应用 ⑴利用固定化微生物生产 ①醇类 ②氨基酸 ③有机酸 ④酶和辅酶 ⑤抗生素 ⑥其它 ⑵制造微生物传感器 3、固定化植物细胞的特点 ⑴由于载体的保护作用，可减轻剪切力等的影响，提高细胞存活率和稳定性； ⑵不易聚集成团； ⑶可以简便的在不同阶段更换不同的培养液； ⑷可反复使用或连续使用，提高生产效率； ⑸利于产品的分离纯化，提高产品质量。 4、固定化植物细胞的应用 主要用于制造人工种子，还可用于生产各种色素、香精、药物、酶等次级代谢物（胞外产物）。 5、固定化动物细胞的特点 ⑴提高细胞存活率和稳定性； ⑵提高产率； ⑶可反复使用或连续使用； ⑷利于产品的分离纯化，提高产品质量。 6、固定化动物细胞的应用 主要用于生产各种疫苗、激素、酶类和药物等，以及皮肤等各种组织器官。 三、固定化原生质体的应用 除去细胞壁可增加细胞膜的通透性，使较多的胞内物质分泌到胞外。 1、固定化原生质体的制备 收集对数生长期的细胞→悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中→加