SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定蛋白质分子量_图文.docVIP

生物秀实验频道——生命科学实验中心 /bio101 四. 实验过程 5.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去 底端的琼脂糖. ※要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果. 6、加样三个。 （1）取10μl标准蛋白溶解液于EP管内，再 加入10μl 2倍样品缓冲液，上样量为20μl。 （2）取10μl样品1溶液，再加入10μl 2倍样品缓冲液，上 样量分别为5μl 和10μl。 7.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在 沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。 ※注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下 沉时会发生扩散. ※为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样. 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 /bbs 生物秀实验频道——生命科学实验中心 /bio101 四. 实验过程 8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒 定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边 缘约5mm时，停止电泳。 做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱 色，直到蛋白质区带清晰。 ※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分. . 11.实验结果分析。 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 /bbs 9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板 生物秀实验频道——生命科学实验中心 /bio101 五.分析计算 绘制标准曲线： 按下式计算相对迁移率： 相对迁移率 = 蛋白样品距加样端迁移距离（cm） 溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm） 以每个蛋白标准的分子量对数对它的 相对迁移率作图得标准曲线，量出未 知蛋白的迁移率即可测出其分于量， 这样的标难曲线只对同一块凝胶上的 样品的分子量测定才具有可靠性。 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 /bbs 生物秀实验频道——生命科学实验中心 /bio101 六.思考题 ? 在不连续体系 SDS中 ,当分离胶加完后,需 ? ? ? 在其上加一层水,为什么? 电极缓冲液中甘氨酸的作用? 在不连续体系 SDS中 , 分离胶与浓缩胶中 均含有TEMED和AP,试述其作用? 样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟? 生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区 /bbs