干旱胁迫下黄花苜蓿与蒺藜苜蓿两个抑制性差减杂交文库的构建及分析.docVIP

第２１卷第６期 Ｖ０１．２１，Ｎｏ．６草业学报ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ１７５—１８１２０１２年１２月 干旱胁迫下黄花苜蓿与蒺藜苜蓿两个抑制性 差减杂交文库的构建及分析 王天佐，赵敏桂”，张文浩 （中国科学院植物研究所植被与环境变化国家重点实验室，北京１０００９３） 摘要：水分胁迫是植物面临的最主要的非生物胁迫之一，研究植物的抗旱机理以提高植物的抗旱能力具有重大的 意义。抑制性差减杂交是一种筛选特异表达基因的良好手段，使用该方法成功构建了豆科植物黄花苜蓿和蒺藜苜 蓿２个差减文库并进行测序。通过ＧＯ分类和ＫＥＧＧ分析等手段对文库中序列进行分类，并分析表达序列的差 异，发现黄花苜蓿文库中对抵抗水分胁迫起积极作用的基因表达序列明显多于蒺藜苜蓿。此外，还对筛选到的２ 个基因在２种苜蓿中的干旱响应表达模式进行了分析，结果表明，在黄花苜蓿中这２个基因的表达更加有利于响 应和抵抗干旱。这些结果在分子层面上一定程度的解释了黄花苜蓿较蒺藜苜蓿更加抗旱的原因。 关键词：黄花苜蓿；蒺藜苜蓿；干旱；抑制性差减杂交（ｓｓＨ） 中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５５１＋．７０３．４；Ｑ９４５．７８文献标识码：Ａ文章编号：１００４—５７５９（２０１２）０６—０１７５—０７ 水资源缺乏是一个全球性的问题，地球上有１／３以上的陆地是干旱和半干旱地区，而中国是主要的干旱国家之一，干旱半干旱土地面积占国土面积的５０％以上。水分是植物生存所必需的，干旱胁迫会严重地影响植物的生长发育，造成作物大面积减产ｒ１］。干旱对农业和社会造成的损失相当于其他各类自然灾害造成的损失之和［２］。日益加剧的水资源短缺与植物的正常生长之问形成了激烈的矛盾，因此，通过揭示抗旱植物抵抗胁迫的机理，以寻找提高植物抗旱能力的途径势在必行。 黄花苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ．屈ｌｃａｔａ）是一种具有突出经济价值和生态功能的多年生优质豆科牧草，在我国分布广泛，内蒙古、新疆分布较多门］。黄花苜蓿属于耐寒的旱中生植物，抗旱、耐寒、耐盐碱、耐风沙、耐贫瘠、抗病虫害。由于黄花苜蓿具有优异的抗逆性，所以在苜蓿的育种实践中，黄花苜蓿常常作为父本与高产的紫花苜蓿杂交，来培育苜蓿新品种卧“］。Ｐｅｎｎｙｃｏｏｋｅ等口１对黄花苜蓿和蒺藜苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）冷响应基因的结构进行了分析，发现黄花苜蓿基因组中编码诸如胚胎发育晚期丰富蛋白的同源基因较多，并且其上游具有多个识别低温信号的ＣＲＴ／ＤＲＥ元件（ｃ—ｒｅｐｅａｔｅｄ／ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｍｏｔｉｆｓ），这是黄花苜蓿较蒺藜苜蓿抗冷的分子机理之一。另外，在低温胁迫下，黄花苜蓿体内积累的脯氨酸和可溶性糖比蒺藜苜蓿占优势［８］。黄花苜蓿在低磷胁迫下能通过大量合成植物激素乙烯，调控其根系的水分运输和酸性磷酸酶的活性［９’１…，黄花苜蓿还能通过根系大量分泌柠檬酸，活化根际难溶态磷来提高在磷胁迫条件下对磷的吸收［１１｜。在水分胁迫下，黄花苜蓿具有形态学上的优势：根系发达，入土深度达２ｍ，侧根沿水平方向扩展；上表皮气孔小，下表皮气孔多［３］。干旱胁迫下，黄花苜蓿较其他品种能够积累更多的可溶性糖，保持较高的光合速率，拥有较强的抗氧化系统［１２｜。虽然国内外对黄花苜蓿抗旱的生理机理研究已取得一定的成果，但对其抗旱的分子机理研究尚未见报道。因此，对黄花苜蓿抗旱分子调控机制的研究是极其有意义和亟待进行的。但由于黄花苜蓿遗传背景比较复杂，分子生物学研究稀少，直接对其进行抗旱分子机理研究存在一定的困难。由于黄花苜蓿与豆科模式植物蒺藜苜蓿有着紧密的亲缘关系，蒺藜苜蓿基因组小、自花授粉、丰富的基因组信息、完善的转化体系［１胡以及现有的对蒺藜苜蓿抗旱的研究＇１４。“３为研究黄花苜蓿抵抗水分胁迫的机理提供了便利。 抑制性扣除杂交（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＳＳＨ）是一种比较和分离不同细胞系、不同组织间收稿日期：２０１１－１２０６；改回日期基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）项目（２００７ＣＢｌ０６８００）资助。 作者简介：王天佐（１９８５），男，山东潍坊人，助理研究员，博士。Ｅ—ｍａｉｌ：ｔｚｗａｎｇ＠ｉｂｃａｓ．ａｃ．ｃｎ ＊通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｏｍｉｎｇｕｉ＠ｉｂｃａｓ．ａｃ．ｃｎ 万方数据 ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１２）Ｖ０１．２１，ＮＯ．６ 或同一细胞系、同一组织在不同条件下有差别表达基因的方法。抑制性消减杂交法是寻找重要功能基因的新方法，它通过单链ＴｅｓｔｅｒｃＤＮＡ的消减均等化，以及两轮抑制性ＰＣＲ使高低丰度的差异表达基因均能有效地进行分离，并可同时得到多条片段［１７。。ＳＳＨ技术已经成功的用于苜蓿差减文库的构建［