基因工程的酶学基础5.pptxVIP

工具酶（instrumental enzyme of gene enginering）是应用于基因工程的各种酶的总称。 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。 到目前为止，常用的工具酶有300多种。 ;工具酶;;（1）定义 (restriction endonuclease），这类酶又称为限制性内切酶或限制酶 。 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶，结果产生具有3’羟基和5’磷酸基团的片断。;;一把特殊的剪刀—限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖; 细菌的限制—修饰作用;噬菌体侵染细菌;E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶;;R-M系统;;;（2）分类; 1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。 分子量较大??反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。 切割DNA的方式是：先与双链DNA上未加修饰的识别序列相互作用，然后沿着DNA分子移动，在行进相当于1?000～5?000个核苷酸的距离之后在随机位置上切割单链DNA。 这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。 ;Ⅱ型酶;Ⅲ型酶;（3） Ⅱ型酶的基本特性;限制性核酸内切酶的类型;第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一个字母。 第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母。 其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。 罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。 例：EcoR I: 来自于Escheria coli RY13的第一个限制酶。;;2. DNA的体外切割;（1）限制性核酸酶的识别序列;（1）限制性核酸酶的识别序列;EcoR Ⅰ：;; 限制酶（Ⅱ型）识别及切割位点 特异识别及切割4?8个bp长度且具有回文序列的DNA片断，主要产生3种末端结构： 5ˊ－粘性末端 3ˊ－粘性末端 平端或钝端 平齐末端:有些限制性内切酶在同一位点平齐切割DNA两条链，而形成两端平整的DNA分子. 粘性末端(sticky end)是指经内切酶特异切割后产生的5ˊ－末端突出和3ˊ－末端突出的碱基序列相互间具有互补性。;三种酶切末端;③同裂酶与同尾酶;在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切； 切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端，称为同识异切。 ;同裂酶——同识同切;同裂酶——同识异切;③同裂酶与同尾酶;同尾酶（isocaudamer）：指来源不同、识别靶序列不同，但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。 杂种位点（hybrid site）：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。 这种杂种位点的结构一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。;5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’;③同裂酶与同尾酶;（2）限制性核酸内切酶的酶切位点;酶切位点;粘性末端 ;平末端;（3）限制酶酶切DNA的方法;二.DNA连接酶与DNA分子的体外连接;重组DNA技术相关概念 ;技术水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）　;DNA克隆 基因克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称或重组DNA (recombinant DNA) 。 ;1. DNA片断的体外连接方法;2. DNA连接酶(DNA ligase);需能反应：;缺口nick和裂口gap;常用DNA ligase 来源;; 影响连接酶作用的因素;3. DNA片断之间的连接;（1）具有互补粘性末端片断之间的连接;（1）具有互补粘性末端片断之间的连接;碱性磷酸酯酶???;主要用途：;;（2）平（齐）末端片断之间的连接;;（2）平（齐）末端片断之间的连接;末端转移酶????;末端 （脱氧核苷酸）转移酶(TdT) ;同聚物加尾法; ;衔接物