日本沼虾半胱氨酸蛋白酶抑制因子基因的克隆及其组织.pdf

中国水产科学 2018 年9 月, 25(5): 915927 Journal of Fishery Sciences of China 研究论文 DOI: 10.3724/SP.J.1118.2018.17369 日本沼虾半胱氨酸蛋白酶抑制因子基因的克隆及其组织表达特征 1, 2, 3 3 2 2 3 3 1 3 江红霞 , 李喜莲 , 侯富军 , 刘勇杰, 李飞 , 张宇飞, 郭建林, 贾永义, 顾志敏3, 刘小林2 1. 河南师范大学 水产学院, 河南 新乡 453007; 2. 西北农林科技大学 动物科技学院, 陕西省农业分子生物学重点实验室, 陕西 杨凌 712100; 3. 浙江省淡水水产研究所, 农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室 , 浙江省鱼类健康与营养重点实验室, 浙江 湖州 313001 摘要: 半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CST)是一种能够可逆结合并抑制半胱氨酸蛋白酶类的活性的蛋白, 为了明确日本 沼虾(Macrobrachium nipponense)CST 基因(MnCST)序列及其在日本沼虾卵巢中的作用, 本研究利用 RACE 方法克 隆获得日本沼虾 MnCST 全长 cDNA 序列, 利用 qRT-PCR 分析了其在不同组织和不同发育阶段的卵巢中的表达情 况, 并利用 RNA 干扰(RNAi)技术初步分析了 MnCST 在日本沼虾卵巢发育中的作用。结果显示, MnCST cDNA 序 列全长 6199 bp, 包含 1183 bp 5′非编码区、2304 bp 3′非编码区和 2709 bp 开放阅读框, 编码 903 个氨基酸残基, 其 氨基酸序列上有 6 个 cystatin-like(半胱氨酸蛋白酶抑制因子样)结构域和 42 个磷酸化位点 ; MnCST 基因在各个组织 中均有表达, 肠中表达量最高 ; 日本沼虾不同发育阶段的卵巢中均有 MnCST 基因表达 , Ⅳ期卵巢中表达量最高, Ⅱ期卵巢中表达量最低; MnCST 基因在日本沼虾卵巢中的表达变化与组织蛋白酶 B(CtsB)和组织蛋白酶 L(CtsL)基 因的表达变化基本是一致的, 但对卵黄蛋白原( Vg)基因的表达没有直接影响。MnCST 在日本沼虾卵巢中的作用可 能主要是抑制 CtsB 和 CtsL 的活性, 在日本沼虾卵巢发育过程中对 Vg 的水解起间接的调控作用。 关键词: 日本沼虾; 半胱氨酸蛋白酶抑制因子 ; 基因克隆 ; 组织表达 ; RNA 干扰 中图分类号: S917 文献标志码: A 文章编号: 10058737(2018)05091513 半胱氨酸蛋白酶抑制因子(cystatins, CSTs)是 每个结构域都具有两个二硫键[3] 。 一类能够与半胱氨酸蛋白酶特异性可逆结合并抑 CSTs 在哺乳动物、鸟类和鱼类等脊椎动物中 制半胱氨酸蛋白酶类活性的家族蛋白 [1] 。已知的 广泛存在[4-8], 一些无脊椎动物的 CSTs 也被鉴别 动物 CSTs 蛋白被分成 3 个家族, 家族 1 的 CSTs 出来, 包括肝片吸虫(Fasciola hepatica)[9] 、棘唇线 也被称为 stefins, 它们是低分子量的蛋白, 并且只 虫 (Acanthocheilonema viteae) 、 马 来 丝 虫 (Brugia 有单个不包含二硫键和碳水化合物侧链的 cystatin malayi)[10] 、旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)[11] 、 结构域[2] 。家族 2 的 CSTs 包括 cystatin C、D 、E 、 巴西日圆线虫(Nippostrong