致病性菌检测方法-国家标准.docVIP

大肠杆菌检测方法 一、检测流程图 稀释液（ 1：10）10 ml 10 ml 双倍乳糖胆盐培养基 44± 0.5℃ 24-48 h 不产酸不产气 产酸产气 37℃ 18-24h 划线伊红美蓝 1-2 滴到蛋白胨水 44± 0.5℃ 24 h 无典型菌落 加靛基质试剂 0.5ml *典型菌落 革兰氏镜检 阳性：玫瑰红色 阴性：试剂本色 非阴性短杆菌 阴性短杆菌 粪大肠杆菌 注： （1） 代表非粪大肠杆菌，没必要在进行下一步鉴定。 （2）典型菌落：深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，具有金属光泽。也有呈紫黑 色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落。 二、培养基和试剂 1. 双倍乳糖胆盐培养基（货号： 022041，厂家：广东环凯微生物科技有限公司） 称取 60 g 到 1 L 蒸馏水或去离子水， 加热搅拌完全溶解， 分装到带有小倒管的试管， 115℃ 高压灭菌 20 min。 2. 伊红美蓝培养基（货号： 022060，厂家：广东环凯微生物科技有限公司） 称取 37.5 g，加入蒸馏水或去离子水 1 L ，121℃高压灭菌 15 min。 3. 蛋白胨水（货号： 022110，厂家：广东环凯微生物科技有限公司） 称取 25 g 到 1 L 蒸馏水或去离子水，加热搅拌完全溶解，分装到试管， 121℃高压灭菌 15 min 。 4. 靛基质试剂 柯凡克试剂： 5 g 对二甲氨基苯甲醛溶于 75 ml 戊醇，缓慢加入浓盐酸 25 ml。 5. 革兰氏染色 1）染液制备 结晶紫染色液，革兰氏碘液，脱色液（ 95%乙醇），复染液（沙黄复染液 /稀石碳酸复红液） 2）染色法 A 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染 1 min，水洗。 B 滴加革兰氏碘液，作用 1 min ，水洗。 C 滴加 95%乙醇脱色，约 30 s，或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂 片，脱色 10 s，水洗。 D 滴加复染液，复燃 1 min，水洗，待干，镜检。 3）染色结果 革兰氏阳性呈紫色，革兰氏阴性呈红色。 铜绿假单胞杆菌检测方法 一、 检测流程图 稀释液（1：10）10 ml 90 ml SCDLP（* 增菌培养） 37 ℃，18-24 h 无薄菌膜， 培养液非黄绿色或蓝绿色 薄菌膜，培养液黄绿色或蓝绿色 十六烷基三甲基溴化铵培养基 37 ℃，18-24 h 无典型菌落 *典型菌落 革兰氏染色 *氧化酶试验 *绿脓菌素试验 *硝酸盐还原产气试验 *明胶液化试验 *42 ℃生长试验 阳 性 阴 性 阴 性 阳性： 粉红色 / 紫红色 阴 性 阳性：粉 红色/紫 红色 阴 性 : 无 气 阳性： 产气 阴性： 凝固 不溶 阳性： 粉红色 / 紫红色 阴性： 不生 长 阳性： 生长 注： （1） 代表非铜绿假单胞杆菌，没必要在进行下一步鉴定。 （2）典型菌落：扁平无定形，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周 围培养基常扩散有水溶性色素。 （3）氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片放在平皿内，用无菌玻璃棒挑取可疑菌落涂 在滤纸上。滴加一滴新配制的 1%二甲基对苯二胺试剂，在 15s-30s 之内出现粉红色或紫红 色为阳性，阴性不变色。 （4）绿脓菌素试验：取可疑菌落 2-3 个，分别接种在绿脓菌素测定培养基上，置 37℃培养 24h，加入氯仿 3-5ml，充分振荡是培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿内，待提取液为蓝色时， 将其转移到试管并加入 1mol/L 盐酸 1ml，振荡，静置。上层盐酸出现粉红色到紫红色为阳 性。 （5）硝酸盐还原产气试验：取可疑菌落，接种硝酸盐蛋白胨水培养基， 37℃培养 24h。小 倒管有气体为阳性。 （6）明胶液化试验： 取可疑菌落， 穿刺接种在明胶培养基， 37℃培养 24h 后，放冰箱 10-30min， 阳性呈溶解状，阴性为凝固不溶。 （7）42℃生长实验：取可疑菌落接种普通培养基， 41-42℃培养 24-48h，若能生长为阳性， 不生长为阴性。 二、培养基和试剂 1. SCDLP 液体培养基（货号： 027010，厂家：广东环凯微生物科技有限公司） 称取 38 g 到 1 L 蒸馏水或去离子水，加热搅拌完全溶解，分装量 90ml，121℃高压灭菌 20 min。 2. 十六烷基三甲基溴化铵培养基（货号： 027040，厂家：广东环凯微生物科技有限公司） 称取 33.3g 到 1 L 蒸馏水或去离子水， 115℃高压灭菌 20 min 。 3. 绿脓菌素测定用培养基（货号： 027050，厂家：广东环凯微生物科技有限公司） 称取 46.4g 到 1 L 蒸馏水或去离子水， 再加 10g甘油，加热搅拌完全溶解， 分装试管， 115℃ 高压灭菌 20 min。放置成斜面。 4. 硝酸盐蛋白