脐血来源VECs与ADSCs联合培养移植修复颌... - 云南.docVIP

脐血来源VECs与ADSCs联合培养移植修复颌骨缺损研究 （一） 中文摘要 目的：为解决组织工程骨血管化缓慢，新骨生长迟缓等问题，在构建组织工程骨时不仅需要植入有成骨潜能的干细胞，而且同时植入加速血管形成的内皮细胞。血管内皮细胞（Vascular Endothelial Cells，VECs）可以有力的支持脂肪干细胞（Adipose-Derived Stromal Cells，ADSCs）向成骨方向转变，还可以加快血管的发生为干细胞的成骨提供营养支持。有血管内皮细胞参与的联合培养的骨组织工程种子细胞越来越成为有希望在临床上应用。本实验研究在体、外情况下，在联合培养体系中血管内皮细胞对脂肪干细胞的增殖、成骨分化的影响；确定联合培养ADSCs和VECs作为种子细胞的生物工程骨修复骨缺损能力。 方法：⑴分离大鼠脐血单个核细胞，血管内皮诱导液培养分化，于3周、6周进行免疫荧光染色检测贴壁细胞CD34、CD133 、Flk-1、vWF表面标志。⑵用4种不同类型的血清培养基分离培养大鼠脂肪干细胞，免疫荧光法检测培养细胞CD34、CD133 、Flk-1表面标志；成骨诱导液诱导分化，于14天进行碱性磷酸酶和钙染色检验各细胞成骨分化特性。⑶取脂肪干细胞与脐血源血管内皮细胞按照血管内皮细胞、3:1 、1:3 、1:1 、脂肪干细胞的浓度共同培养；分别倒置显微镜下观察联合细胞的形态变化；MTT法描出各浓度细胞的生长曲线，比较各组细胞生长曲线差异；7、14天各组ALP试剂盒测定细胞内碱性磷酸酶活性和饱和茜素红钙染色；倒置显微镜下观察碱性磷酸酶和骨钙分泌情况；4、7、14天定量测定各组细胞碱性磷酸酶和骨钙素含量。⑷用猪椎骨制备部分脱蛋白骨，纤维粘连蛋白修饰制成部分脱蛋白生物骨，扫描电镜观察；脂肪干细胞和血管内皮细胞接种部分脱蛋白骨和部分脱蛋白生物骨片，MTT法检测吸光度，评价纤维粘连蛋白脂肪干细胞在PDPB生长影响及三种不同细胞组在PDPBB生长情况，分析移植最佳时机，扫描电镜观察不同细胞组在PDPBB生长情况。⑸分别用BrdU标记的 血管内皮细胞、脂肪干细胞和联合培养细胞体外复合部分脱蛋白生物骨，植于SD大鼠两侧股部肌袋处；流式细胞仪检测外周血CD3、CD4、CD8因子情况，根据CD4/CD8分析外周血T淋巴亚群情况来分析机体植入组织工程骨的免疫排斥情况；硬组织切片计算比较新骨成骨量；硬组织切片中Brdu抗体免疫荧光染色，观察植入的种子细胞在机体内的增殖分化情况。⑹取健康SD大鼠60只，随机分为5组（A组：PDPBB﹢血管内皮细胞组；B组;PDPBB﹢脂肪干细胞组；C组：PDPBB﹢1:1联合培养细胞组；D组：单纯PDPBB组；E组：空白组），在下颌骨体部椎板咬骨钳制造0.5×0.4临界骨缺损，分别将组织工程骨植于SD大鼠下颌骨骨缺损处；E组做空白对照； X线检查及硬组织切片分析新骨面积成骨量。 结果：⑴培养3周脐血单个核细胞CD34、CD133 、Flk-1、vWF抗体免疫荧光检测均为阳性；六周免疫荧光染色可见CD34、Flk-1、vWF为阳性，CD133部分为阳性。⑵脂肪干细胞培养新生牛血清组贴壁单个核细胞形态单一，呈梭形生长，免疫荧光检测可见CD34、CD133 、Flk-1染色均为阴性；成骨诱导后碱性磷酸酶阳性；茜素红染色可见大量红色钙结节影；胎牛血清组大量多角细胞呈巢状生长，形成铺路石样形态，间或有梭形细胞存在；多角形细胞CD34、Flk-1均为阳性，CD133部分为阳性，梭形细胞均为阴性；成骨诱导后多角状细胞死亡，形成空白区，梭形细胞呈碱性磷酸酶和钙结节阳性。⑶体外联合培养细胞1:1和3:1组14天细胞之间出现许多突触相互连接，部分细胞融合成团块状，其余组细胞未见细胞团出现。生长曲线可见各组混合细胞吸光度逐渐升高，脂肪干细胞、3:1 、1:3 、1；1浓度组12天时处于高峰，1:1浓度组吸光度最高；血管内皮细胞组第10天吸光度达到高峰；随后各浓度组细胞吸光度逐渐下降，差异有统计学意义。⑷体外培养第7天时ALP染色脂肪干细胞、3:1、血管内皮细胞组呈阴性反应，1:3和1:1组混合培养细胞部分细胞阳性；茜素红骨钙检测各组均未发现红色阳性细胞。14天时ALP染色脂肪干细胞、血管内皮细胞组仍呈阴性反应，3:1、1:3和1:1组混合培养细胞可见片状阳性细胞；茜素红骨钙检测3:1、1:3和1:1组混合培养细胞极少数阳性细胞，其余各组未发现阳性细胞；各组ALP检测量随时间延长逐渐增高，各时间1:1组ALP最高；脂肪干细胞组和血管内皮细胞组ALP基本没有变化；1:1组和其它各组之间两两比较均有显著统计学意义（P﹤0.01）；各组OC检测量随时间延长逐渐增高，4天时1:3组OC最高； 7天和14天时1:1组OC最高； 1:1组和其它各组之间两两比较均有显