糖皮质激素受体α调节剂高通量筛选模型的建立及.pdf

110 中国医药生物技术 2014 年 4 月第 9 卷第 2 期 Chin Med Biotechnol, April 2014, Vol. 9, No. 2 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.02.005 ·论著· 糖皮质激素受体 α调节剂 高通量筛选模型的建立及应用 孙彩霞，张振亮，郑海洲，路新华，郑智慧，赵宝华，段宝玲 【摘要】 节效果，最终引起各种生物学效应[3-4] 。GR 被报道 目的 建立不同分子作用机制的糖皮质激素受体 α （GRα） 参与机体应激反应，具有抗炎、免疫、促细胞凋亡、 调节剂高通量筛选模型，筛选新型糖皮质激素受体调节剂。 参与糖代谢等作用[5-9] 。GR 的调节剂（激动剂和拮 方法 克隆 GRα 的配体结合域 LBD 和全长基因，构建哺 抗剂）被用于哮喘、炎症、免疫、肺栓性肺炎 乳动物细胞表达载体 pBIND-GAL4-GRα LBD 、pTARGET- （COPD ）、糖尿病等疾病治疗。Horizon 制药公司 GRα，分别与已构建的含 GAL4 响应元件 5 × UAS 的荧光 的强的松，能治疗关节炎、平喘、慢性梗阻性肺部 素酶报告质粒 p5 × UAS-luc 和含有 4 × GRE 的报告质粒 疾病并且有止痛作用。目前国际上仍有制药公司进 pGRE-luc 共转染 HeLa 细胞，建立两种不同机制的报告基 行新的 GR 调节药物的研究开发。 因细胞筛选方法，通过报告基因的表达检测化合物对 GRα 本研究为了发现和研究新的 GR 调节剂，研制 受体转录调控功能的调节剂作用；利用实时定量 PCR 方法 和开发新的 GR 调节剂候选药物，基于 GR 的作 进一步验证化合物对糖皮质激素受体靶基因 mRNA 水平 用机制，利用分子生物学技术建立了细胞水平报告 的调控作用。 基因 GRα （GR 的一种亚型）调节剂高通量筛选模 结果 经过分别共转染表达质粒和报告质粒，GRα 激动剂 型[10] 。本文主要对筛选方法的建立、验证及筛选结 地塞米松可剂量依赖地诱导 5 × UAS-luc 和 4 × GRE-luc 果进行报道。 两个模型的荧光素酶的表达，在 5 × UAS-luc 模型中，最大 上调倍数可达（9.0 ± 0.2 ）倍，EC50 值为（0.28 ± 0.07 ）mmol/L ， 1 材料与方法 Z 因子为 0.52 。在 4 × GRE-luc 模型中，最大上调倍数可 1.1 材料 达（3.2 ± 0.3 ）倍，EC50 值为（1.81 ± 0.13）mmol/L ，Z 因 1.1.1 质粒、菌种和细胞株 pGEM-T easy 载体 子为 0.49 。利用模型 pBIND-GAL4-GRα LBD/p5 × UAS-luc 购于美国 Promega 公司；pBIND 启动子载体、 从 2000 多个微生物和植物来源的天然以及合成化合物中 pTARGET 、HeLa 细胞为本实验室保存；GRE-luc 筛选得到 1 个微生物来源的天然产物黑麦酮酸 D ，黑麦酮 报告质粒购于上海碧云天公司；p5 × UAS-luc 报告 酸 D 对 GRα 具有 2 ~ 3 倍的激动活性。进一步的定量 质粒为本实验室构建[10] 。 PCR 的结果说明黑麦酮酸 D 能有效上调多个 GRα 调控 1.1.2 主要仪器 GeneAmp PCR System 为美国 的靶基因的表达。 Backman 公司产品；HERA cell CO2 培养箱为美国 科峻仪器公司产品