甄氏外瓶霉的PCR－RFLP分型研究.docVIP

???? 甄氏外瓶霉的PCR－RFLP分型研究 ???? ???? 【摘要】目的对不同来源的甄氏外瓶霉进行分析，为建立更为合理的分型方法提供依据。方法以ITS3和ITS4为引物，对17株甄氏外瓶霉的核糖体DNA转录间隔区（ITSⅡ）进行扩增，4种内切酶（HinFⅠ、MspⅠ、BsuRⅠ和RsaⅠ）酶切。结果ITSⅡ区扩增片段约为330bp，17个菌株可分为Ⅵ型，3株变种分属于不同的型，BMU00195带型独特，有可能为新变种或新种；种群关系与来源显示出一定的相关性。结论PCR－RFLP用于甄氏外瓶霉的分型研究较为可靠，对于确定有争议菌种的分类学地位具有重要的意义。【关键词】甄氏外瓶霉 随机扩增多态DNA技术 PCR－ribotyping of Exophiala jeanselmei LI Dongming，LI Ruoyu，WANG Duanli，et al.(Department of Dermatology, First Hospital, Peking University, Beijing 100034) 【Abstract】 Objective To analyze Exophiala jeanselmei strains recovered from different sources and to establish a better method for typing the strains in this species. Methods The ribosomal internal transcribed spacer regions (ITSⅡ ) of 17 isolates Exophiala jeanselmei were amplified with primer ITS3 and ITS4 and digested with four restriction enzymes (HinFⅠ , MspⅠ , BsuRⅠ and RsaⅠ ). Results The amplicon length of the ITSⅡ was about 330bp, and 6 types of characteristic patterns for the species were found after restriction analysis. The variants of E. jeanselmei were unrelated and should therefore be maintained as separate species. The unique patterns of isolate BMU00195 were shown,which seems probably to be a new variant or even a new species. Conclusions PCR－ RFLP is useful for the typing and identification of Exophiala jeanselmei, which is important in confirming the taxonomic position of a complex species.【Key words】 Exophiala jeanselmei Random amplified polymorphic DNA technique 　　外瓶霉（Exophialaspp,E）为暗色丝孢霉病的主要致病菌之一，而甄氏外瓶霉（E.jeanselmei）是外瓶霉属中致病性较强的一个种，易侵犯皮肤、上消化道及心血管系统，且病灶可血行播散[1,2]。该种内各亚种间变异性较大，且侵袭力、毒力均有差别，对药物的反应性亦不同。由于该类真菌形态及生理生化性质差异较小，传统的分型方法往往不能满足需要，分子生物学技术的发展为从基因水平上揭示真菌的亲缘关系提供了新的手段。近年来，核糖体DNA（rDNA）内转录间隔区（internaltranscribedspacer，ITS）已被应用于外瓶霉及其相近属种的分类中。本实验在国际上首次将PCR－RFLP应用于甄氏外瓶霉的种内分型研究，以期为建立更为合理的分类体系提供依据。 　　材料和方法 　　一、标本来源　　包括甄氏外瓶霉及其变种共17株，均为北京大学真菌和真菌病研究中心保存菌株。　　二、实验方法　　————————　　（一）DNA提取：将实验菌株接种于PDA，27℃培养2周，收集菌丝体约0.1g，用氯化苄法提取DNA[3]，并在质量分数为0.8％琼脂糖凝胶上检测DNA的量和浓度。　　（二）PCR扩增：应用引物ITS3和ITS4[4]（华美公司合