0303 组织细胞的三维培养.ppt

组织细胞的三维培养 学生：张旭朗 导师：马小军 研究员 2005－5－18 概念 三维培养的构成 三维培养的特点 三维培养的方法 研究方法 三维培养的应用 展望 一、三维培养的概念 相对于单层细胞的二维培养而言，利用各种方法及材料，使细胞呈空间立体方式生长，形成类似体内组织的结构，发挥其功能 二、三维培养的构成 1、辅助物：人工软骨[1]、PET聚乙烯酯[2]、纤维蛋白支架[3]、胶原支架[4-5]、旋转生物反应器[6]、微胶囊[7]、中空纤维[8] 2、细胞：原代组织细胞－大鼠肝、软骨、 脂肪[9]、成骨样细胞、干细胞[10]、 肿瘤细胞[11] 三、三维培养的特点 1、生长特点：三维结构、异质性、生长速率及氧气、葡萄糖等梯度分布 2、组织学特点：细胞分三层（直径300μm） 可有类似组织基质的物质产生 3、生长动力学：三维培养细胞以G1/G0期细胞占优势，S期细胞较少 四、三维培养的方法 1、旋转式培养：旋转细胞培养系统或培养瓶，旋转生物反应器同时产生较多量直径为1－2mm的细胞球 2、非黏附物包被的培养瓶或培养皿：琼脂、琼脂糖、蛋白聚糖、聚苯乙烯 3、支架 五、研究方法 1、细胞生长及形态：体积－直径 免疫组化（BrdU、PCNA、Ki-67） 流式细胞仪（DNA Hoechst33342、PI） 电镜 2、细胞球的生理特性：微电极（pO2 or pH） NMR(脂代谢) 生物体发光技术（ATP、Lactate、glucose） 六、三维培养的应用 1、实验性治疗 ⑴放射效应[12]：分化程度影响放疗效果 ⑵药物耐受[13]：培养方式是决定耐药的因素之一 ⑶免疫疗法[14]：肿瘤细胞与免疫细胞作用 2、代谢及代谢环境研究 三维培养的细胞可模拟肿瘤生成中的无血管阶段、微转移灶或毛细血管之间的微区域 模拟在体细胞的环境： ⑴良好生长环境 ⑵缺氧、缺乏营养、废物积聚或pH降低等协同作用－－－“toxic enviroment” [15] 3、细胞的生物学特性 ⑴浸润和转移：肿瘤细胞和基质共培养（E-cadherin、 ICAM-1 ）[16,17] ⑵细胞黏附：研究细胞聚集过程中黏附因子的作用[18] ⑶血管形成： VEGF（血管内皮生长因子）在恶性肿瘤血管形成中起主要作用[19] 4、实验性组织模型 移植物以组织或器官的方式培养，使其在一定时间内保持原有功能 简单的讲：使细胞自发或借助人工基质聚集并诱导细胞分化、维持细胞功能 举例：人工肝（肝细胞、纤维细胞等与明胶海绵、琼脂、胶原共培养）[20-22] 5、胚体干细胞与拟胚体 ⑴胚胎发育到囊胚期，此时细胞分化为两大类，即位于周边的滋养层细胞和位于腔内但居于一端的内细胞团（inner cell mass ICM）。只有ICM将来发育成胚胎本身，把ICM从胚胎中分离出来在一定条件下培养，可形成具有无限增殖能力的细胞群，称为胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES细胞） ⑵当ES细胞经过2天悬滴培养、2天悬浮培养后，可形成简单拟胚体（3－D），拟胚体内包含着来源于三个胚层的不同细胞 微囊化肿瘤细胞用于药筛 1、抗肿瘤药物筛选的研究现状 ⑴多采用体外单层培养的肿瘤细胞：简单、易操作、费用低、可大量应用、生长方式及环境与在体肿瘤差距较大 ⑵动物实验：费用高、生存条件苛刻、生长方式及环境与在体相似 ⑶手术切除标本：回顾性研究、不能动态观察 ⑷体外三维培养：模拟肿瘤生长方式及环境、可大量应用、费用较低，如MCTS 肿瘤细胞在体与体外三维生长示意图 2、微囊化细胞三维共培养特点 ⑴微胶囊为半透膜 ⑵细胞呈三维立体生长 ⑶生长空间可控 ⑷空间相对封闭 ⑸“被动”共培养 ⑹实质与间质细胞共培养-模拟体内 3、微囊化肿瘤细胞的三维培养 ⑴材料：海藻酸钠，聚赖氨酸，人乳腺癌 细胞系MCF-7 ⑵方法：静电液滴法 Day 2 4、药物对三维生长细胞的抑制 ⑴药物：丝裂霉素（MC）、阿霉素（ADM）、5－氟尿嘧啶（5－FU） ⑵浓度和作用时间：0.1ppc,1ppc及10ppc Peak plasma concentration (ppc), the h