安全输血新进展与新技术应用总体介绍.ppt

* * * * * * * * * * * 血液病毒灭活方法评价原则 能有效灭活病毒 指示病毒：HIV、DHBV、Sindbis、VSV、脊髓灰质炎病毒…… 方法：细胞病变法、动物感染、PCR 对血液成分活性及功能无明显不良影响 血浆：凝血因子、血浆蛋白回收率、蛋白质免疫原性……. 红细胞：溶血、K+逸出、ATP、2,3-DPG、形态积分、体内回收率…… 血小板：HSR、形态积分、聚集率、CCI……. 对人体安全 急性毒性、慢性毒性、基因毒性 适用于单袋血液成分处理 血浆病毒灭活剂吸附过滤器产品性能指标 一单位新鲜冰冻血浆 白细胞去除率≥99.99% 剩余白细胞数≤1.0×104 总蛋白回收率≥85.0% 光敏剂吸附率≥85.0% 验证方法 健康人血浆，加入不同数量级的模型病毒，同时添加不同浓度的MB，利用医用血浆病毒灭活柜处理不同的时间，通过前后病毒滴度的变化来检验该方法对病毒的灭活效果，并评价最佳的病毒灭活组合。 指示病毒 水疱性口膜炎病毒VSV 小鼠的运动神经元病毒Sindbis 病毒滴度测定 采用有限稀释法，按Ｒeed-Muench方法计算。 │病毒│基因组│脂包膜│大小（nrn） │ 指示病毒举例 │ │HIV │ RNA │ 有 │ 80-100 │ HIV VSV │HBV │ RNA │ 有 │ 45 │鸭乙型肝炎病毒、伪狂犬病毒 │ │HCV │ RNA │ 有 │ 40-60 │牛腹泻病毒、Sindbis病毒 │HAV │ RNA │ 无 │ 27 │HAV、脊髓灰质炎病毒、脑心肌炎病毒 │ B19 │ DNA │ 无 │ 20 │犬细小病毒、猪细小病毒 │ 试验用仪器及试剂 1、医用血浆病毒灭活柜 2、亚甲基蓝 Methylthioninium Chloride； 3、CO2孵育箱（FORMA公司）； 4、健康人血浆（武汉市血液中心提供）； 5、细胞及试剂：Vero E6，293，BHK细胞（中科院武汉病毒所保存）RPMI1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM（GIBCO公司）。 MB光化学灭活工艺对血浆有效成分的影响验证 验证指标 凝血因子保有 总蛋白回收 验证方法 凝血因子效价测定采用自动凝血仪，蛋白含量测定采用双缩脲法测定。 器材及试剂 凝血因子测定采用美国太平洋生物技术公司生产的凝血试剂盒和日本产凝血分析仪 验证结果 凝血因子保有率＞80% 总蛋白回收率＞90% 利用最佳灭活参数组合对血浆进行处理，通过测定处理前后血浆样本的凝血因子效价和蛋白含量的变化以观察MB灭活工艺处理对血浆内凝血因子及蛋白质的影响程度 参数选择 温度：根据现今血液学研究及成分输血应用，血液中各因子的保存 温度为4℃(24h)或-35℃度冷藏，因为工艺灭活在液态条件下进行，结合温度的变化对整个灭活效果的影响，以及灭活柜的机械参数（2—8 ℃ ），所以选择4℃作为血浆处理温度。 MB加入量：MB 作为光敏剂，其加入量不仅对灭活效果有较大影响，而且对血浆蛋白结构也有很大影响，因此将处理时血浆内MB浓度分为0.2μg/ml、 0.5μg/ml、0.8μg/ml进行验证。 针对MB加入量，光照射强度选定为23000、33000lux进行验证。 灭活时间，为了了解病毒灭活速率及保证较明显看到病毒滴度变化，特先取5min ，15min ，30 min和45 min为时间参数验证。 指示病毒灭活效果结果 VSV灭活曲线 图二： Sindbis灭活曲线 结论 MB光化学法对指示病毒VSV， Sindbis具有良好的灭活作用。 在4℃， 23000lux光照， 0.2μg/mlMB，30分钟的处理后VSV， Sindbis的滴度均下降了6个log值以上，灭活效果非常明显。 MB光化学法对Sindbis的灭活效果比对VSV的要强。 临床建议使用4℃，28000lux光照， 0.5μg/mlMB，30分钟的处理。 近年关注的血液病毒灭活方法 亚甲兰光化学法（MB-P） S-59光化学法 核黄素光化学法 FRALE S303+PH调节 PEN110 血液病原体灭活研究的发展取向 病毒灭活 病原体灭活 以病毒灭活为焦点、兼顾细菌、寄生虫、T细胞等病原体的 灭活 血液成分病原体灭活 全血病原体灭活 能有效灭活病原体；对红细胞、血小板、血浆均无 明显损伤 展望 血浆病原体灭活 建立了成熟的方法，经亚甲蓝光化学病毒灭活处理的血浆 已临床应用逾