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HBV定量检测 (HBV Quantitive Detection) 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus HBV） HBV DNA的复制周期（I） HBV颗粒吸附并进入肝细胞 脱去衣壳，病毒DNA进入肝细胞核内 病毒正链以负链为模板，形成开口环状双链DNA （需DNA聚合酶） 以负链DNA为模板转录 (需RNA聚合酶) 2.1kb RNA: 翻译外衣壳蛋白 3.5kb RNA: 翻译内衣壳蛋白，还作为病毒DNA复制的模板（前基因组） 构成完整成熟的病毒颗粒，从细胞浆中释出细胞外 PCR基因的原理 一、PCR技术的发展及原理 1971年，Kleppe等人首次在文章中准确、客观地阐述了PCR方法。 1985年，美国PE-Cetus公司的Kary Mullis等人发明PCR技术。 PCR技术的本质是体外核酸扩增，加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引物同模板DNA杂交，在Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物，重复 “变性→退火→引物延伸”过程至25-40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。 PCR基因扩增仪的工作原理 PCR基因扩增仪工作关键是温度控制 荧光实时定量PCR（real-time quantitative PCR,RQ-PCR） 技术在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号，从而实时监测整个PCR反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。 荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR） 又称实时PCR，目前较精确的进行定量检测PCR的方法 FQ-PCR通过荧光信号对PCR过程中产物量进行实时监测，精确计算出PCR的初始模板量 荧光定量PCR是融合了PCR高灵敏性、DNA杂交高特异性和光谱分析的精确性，直接检测扩增过程中双链DNA荧光信号的变化以获得定量的结果。 系统内装置有半导体PCR、卤钨灯光源激发荧光信号、光栅分光、超低温光电耦合器（CCD）摄象机收集荧光信号、计算机软件分析系统等。 The software displays the fluorescence signals in real-time immediately after each measurement. Signals from the samples are obtained as the machine positions the capillaries sequentially over the optical unit. During thermal cycling, fluorescence can be measured once per cycle for every capillary and the fluorescence values are displayed immediately on the screen and updated after every cycle (Fig.3). The generated data are stored for further analysis. ? 荧光定量PCR检测的是样本的初始浓度，而准确测定初始浓度需要在对数期进行。 ①荧光定量技术要求在低浓度坏境。因为荧光检测定量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立的。如果分子浓度高了，影响作用很复杂，而PCR扩增产物是高浓度的，因此重复性变差也很容易理解。 ②由于扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而产生不可控的影响。 荧光信号的检测方法： 1、DNA结合染料技术 2、水解探针技术（TaqMan probe）技术 3、杂交探针技术 4、分子信标 HBV的定量检测 标本：病人血清200μl 检测：HBV病毒核酸载量 检测样本：阳性对照、阴性对照、空白对照 标准品、病人HBV DNA 检测步骤：HBV DNA提取； 荧光定量 PCR； 结果分析 定量PCR方法：TaqMan水解探针技术 Figure 3. Mutation detection by melting curve analysis. Top panel: melting curves of amplified gene fragments from wild-type and mutant individuals. Bottom panel: negative first derivatives of the melting curves showing the unique