第五章 植物细胞培养和次生代谢产物生产.ppt

第5章 植物细胞培养与次级代谢产物制备;主要内容： 第一节 植物单细胞培养技术 第二节 植物细胞的大规模培养 第三节 植物细胞生物反应器学习的目标与要求： 掌握植物单细胞培养及植物大规模培养的技术要点，认识培养中各个时期细胞的生长特点和各种培养方式。同时了解植物细胞培养的各种细胞生物反应器及生产次生代谢的技术要点。 ;（一）植物细胞培养是指在离体条件下，将分离的细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。 细胞培养是在植物组织培养的基础上发展起来的，理论基础是植物细胞的单个细胞内存在生命体的全部能力（全能性）。 ;（2）植物细胞培养的培养基;（二）植物单细胞培养;1、细胞平板培养;1、细胞平板培养;主要技术要点是：· 单细胞的分离；· 单细胞悬浮液的制备；· 植板 植板率评估：这是平板培养中常用的一个术语，用来反应植板效率的高低。它以能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例来表示。植板率(％)＝(形成的细胞团数/接种的细胞数)×100％;2、看护培养与饲养层培养法;饲养层培养：饲养层培养是用处理过的（如X射线）无活性的或分裂很慢、不具备分裂代谢能力的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。 具体方法： （1）饲养细胞与靶细胞共混合于琼脂培养基中 （2）饲养细胞与靶细胞分别混合于培养基中，前者位于下层，后者位于上层。 （3）饲养细胞与靶细胞一起培养于液体培养基中 （4）双层滤纸植板培养;Horsch等（1980）将平板培养与饲养层培养技术相结合建立了双层滤纸植板培养方法。 双层滤纸植板培养：在饲养层细胞和靶细胞层之间放两张滤纸，上面一层滤纸用于将靶细胞转移到其他培养基上继续培养。;3、微室培养;3、微室培养;4、液体浅层静置培养;5、细胞同步化培养 细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞分裂的某一特定时期。;植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚并进入不同程度的分化状态，因此，要达到完全同步化对于植物细胞培养来讲是十分困难的。 也正是因为同一培养体系的植物细胞通常并不能处于同一细胞周期，这种差异使悬浮细胞的分裂、代谢以及生理生化状态等更趋复杂化。 通过一定的理化措施可以使统一体系中的细胞达到相对同步化。 ;分选法：通过细胞体积大小分级将处于相同周期的细胞进行分选，将同一周期的细胞续代培养于同一体系中，使相同培养体系中的细胞具有较好的一致性。 这种方法的优点是操作简单，分选细胞维持了自然生长状态，因而不会有其它处理而带来的对细胞活力的影响。分选的精细程度较差。 常规细胞分选方法是梯度离心。 精细的分选可采用流式细胞仪。;饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂期，当在培养基中加入所缺乏的成分或者将饥饿细胞转入完整培养基中续代培养时，则细胞分裂又可重新恢复。 饥饿导致的细胞分裂受阻常常是使细胞不能合成DNA，即不能进入M期。因此，通过饥饿法可以获得处于C1和C2期的同步细胞。 研究显示，当细胞处于养饥饿时，通常获得C1期的同步化细胞，当细胞处于磷和碳饥饿时，则获得C1和C2期的同步化细胞（Chawla,1999） ;抑制剂法：通过以下DNA合成抑制处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期C1期的同步化细胞。 常用抑制剂主要有5-氟脱氧尿苷和羟基尿。 通过抑制剂获得的同步细胞基本处于同一个细胞周期，在除去抑制剂后可以不进行分选直接培养，用羟基尿处理获得同步化细胞的方法在小麦、玉米、西芹等植物细胞培养中均有成功应用。 ;低温处理： 冷处理也可以提高培养体系中细胞同步化的程度。Okamura等曾采用此途径使胡萝卜悬浮细胞较好的同步化。梅兴国等（2001）采用6℃低温处理红豆杉细胞液获得较明显的同步效果。 ;6、 细胞系与细胞株;②亚株：由原细胞株进一步分离培养培养出与原株性状不同的细胞群。 （2）适合于工业化生产的细胞株必须满足的条件：①分散性好；②均一性好；③生长速度快；④目标产物含量高，容易分离提取；⑤细胞遗传稳定。 ;(3)细胞株筛选 A、一般步骤 ①愈伤组织的诱导与培养； ② 单细胞分离； ③细胞无性系的分离； ④细胞株筛选； ⑤性能评价； ⑥细胞株获得 ;B、定向富集驯化 ①激素自养型细胞株的筛选驯化； ②耐受高剂量有毒物质的细胞株驯化； 含高浓度的乙酸盐、苯甲酸钠等可能对 细胞产生毒害。 C、人工诱变筛选;（三） 细胞的保存;2、冰冻保存 ①低温保