细胞生物学研究的方式.pptVIP

模型 三、荧光共振能量转移技 (Fluorescence resonance energy transfer,FRET) 检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具,检测某一细胞中两个蛋白分子是否存在直接的相互作用。 490nm荧光 供体 （CFP） 430nm激发光 受体 （YEP） 受体 （YEP） 490nm荧光 供体 （CFP） 430nm激发光 530nm黄色荧光 FRET * * ? TaqMan法 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光 Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针 ? TaqMan探针定量原理 ? TaqMan法PCR反应的建立 1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70℃，30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60℃、 2、反应参数的确定：一般为： 95 ℃, 3min 94 ℃，15S 60 ℃，60S （Taq酶5′→3′外切酶活性在60℃最高也可通过温度梯度优化退火温度） 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM 4、其他与常规PCR相同 40cycles ?Taqman法优缺点 优点 缺点 对目标序列的高特异性--阴性结果确定 引物设计相对简单 重复性比较好 只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态 　利用放射性同位素的电离辐射对乳胶的感光 作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位 与半定位的一种细胞化学技术。 步骤:同位素标记的生物大分子前体掺入；细胞内 同位素所在位置的显示。 六．定量细胞化学分析技术 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些 物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括：紫外光显微分光光度测定法 　　　　　可见光显微分光光度测定法 流式细胞仪（Flow Cytometry） 　主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。 ? 第三节　细胞培养、细胞工程与显微操作系统 一、细胞培养 动物细胞培养类型： 　 原代培养细胞(primary culture cell)：取下细胞、组织的器官后立即进行培养(1-10代以内)。 传代培养细胞（sub-culture cell）：适应在体外培养的持续传代培养的细胞。 　　 细胞株(cell strain):正常二倍体，接触抑制 细胞系(cell line) :亚二倍体，接触抑制丧失，色体明 显改变，容易传代培养。 常用的细胞系：Hela细胞系(子宫颈瘤细胞) BHK21(Baby hamster kidney) CHO(chinese hamster ovary) *培养细胞一般不保持体内原有细胞形态，存在形态： 成纤维样细胞(fibroblast like cell) 上皮样细胞(epithelial like cell 培养方法：贴壁培养，悬浮培养 原代培养的步骤： 取组织块，剪碎，消化分散细胞连接处(胰酶或EDTA)，无菌、培养液中培养。 细胞系(Cell line)：在培养条件下可进行无限分裂的动物或植物细胞群。 细胞株(Cell strain):通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志(Marker)的培养物称为细胞株，细胞株的特定性质功标志必须在整个培养期始终保持。 贴壁培养:分散的细胞悬浮在培养瓶中很快(几十分中至几小时) 就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁，贴壁后的细胞形态形成多态，呈单层生长，所以此法又叫单层细胞培养。单层培养的细胞保持接触抑制特性。 悬浮培养:悬浮培养的细胞在培养过程中不贴壁，一直悬浮在培养液中生长。如T细胞的培养。悬浮培养条件较为复杂，难度也大一些，但是容易同时获得大量的培养细胞。 植物细胞 　　　　类型：单倍体细胞培养（花药培养） 　　　　　　　原生质体培养 （体细胞培养） 非细胞体系（cell-free system） LYTU Cell Biology 二、细胞工程 细胞分化的定向诱导： 基因工程 　　　组织工程 细胞融合：　 杂种细胞