第18章 基因诊断与基因治疗.pptVIP

第 十 八 章 基因诊断与基因治疗 Gene Diagnosis and Gene Therapy 主要内容 教 学 要 求 【教学课时】 2 学时 【掌握内容】 基因诊断的含义、特点；基因治疗的概念。 【熟悉内容】 基因诊断的各种常用技术方法；基因治疗的载 体系统与导入方法。 【了解内容】 基因诊断、基因治疗在医学中的应用 第 一 节基 因 诊 断Gene Diagnosis 二、基因诊断常用技术方法 （一）核酸分子杂交技术 （二）聚合酶链反应 (PCR) （三）基因测序 （四）生物芯片 （一）核酸分子杂交技术 菌落杂交（colony hybridization） 原位杂交（in situ hybridization） 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂 交，进而检测特异的DNA或RNA序列。 细胞原位杂交 组织切片原位杂交 该法优点： 不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。 PCR反应参数 变性温度与时间 退火温度与时间 退火温度决定PCR的特异性；Tm-5?C 延伸温度与时间 Taq DNA聚合酶活性最高温度；35-100 bp/min 循环次数 主要取决于模板DNA的浓度；平台期 Sanger法（双脱氧末端终止法） 三、基因诊断的应用 遗传病 产前诊断、优生优育 肿瘤 了解恶性肿瘤的分子机制，对肿瘤分类分型及预后有指导意义。 感染性疾病 具有快速、灵敏、特异等优点。 法医学中个体识别、亲子鉴定 有些具有个体特征的遗传标记可用于个体识别和亲 子鉴定，如DNA指纹分析、短串联重复（STR）多态性 分析等。 杜氏肌营养不良症(DMD)的基因检测 DMD是一种高发病率、高致残、高致死的X染色体连锁的遗传性疾病，在2500个活产男婴中即有一个患者。 致病基因DMD的全长为250kb，有79个外显子。 DMD 的最主要遗传缺陷是外显子缺失，约占60%~70%。 DMD基因外显子缺失的检测 Southern blot 应用 DNA指纹分析 第 二 节 基 因 治 疗Gene Therapy 基因治疗的方式 根据基因导入的方式分为两种： 1. 直接体内疗法（in vivo）是指将目的基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。 2. 间接体内疗法（ex vivo）是指在体外将目的基因导入靶细胞，经过筛选和增殖后将细胞回输给患者，使该基因在体内有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。 （一）治疗性基因的获得 导入的治疗基因应是与缺陷基因相对应的有功能的同源基因或与缺陷基因无关但有治疗意义的基因。 （二）基因载体的选择 基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。 病毒载体：逆转录病毒(RV)、腺病毒(AV)、腺相关的病毒(AAV)等。 非病毒载体：这类载体的发展较快，目前主要是脂质体。 （三）靶细胞的选择 ---- 间接体内疗法中使用 ---- 分为生殖细胞和体细胞两大类,现阶段只限于应 用体细胞 靶细胞选择的原则: 1.易操作; 2.易培养; 3.易接受外源基因; 4.在体内能持久高效表达 目前常用的靶细胞包括：成纤维细胞、淋巴细胞、上皮细胞、造血细胞、肝细胞、肌细胞等 （四）基因转移方法 化学方法——磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法 物理方法——电穿孔法、粒子轰击法 病毒法——主要通过携带有外源基因的病毒载体感染靶细胞来实现基因的转移。 膜融合法——细胞融合法、脂质体介导法、原生质体融合法、微细胞核介导法等 （五）转导细胞的选择和鉴定 标记基因技术 基因缺陷型受体细胞技术 基因共转染技术 分子杂交技术 外源基因表达鉴定 （六）回输体内 方式：静脉注射、肌注、皮下注射、滴鼻等 基因修饰的淋巴细胞以静脉注射的方式回输到血液中； 将皮肤成纤维细胞以细胞胶原悬液注射至患者皮下组织； 采用自体骨髓移植的方法输入造血细胞； 或以导管技术将血管内皮细胞定位输入血管等。 复习思考题 基因诊断的基本方法主要是建立在核酸分子杂交技术、PCR技术和DNA序列分析技术或几种技术联合应用的基础上。 该法主要用于基因工程研究中重组体的筛选和临床标本检验。 特异性强 近年来，通过采用不同的荧光染料标记四种不同的双脱氧核糖核苷酸，其反应混合物可在同一区带上进行电泳分离，然后用计算机进行阅读和分析，可大大提高测序速度，一个熟练的工作者一天可分析1万个核苷酸顺序。 筛选出的转化细