毕赤酵母基因工程菌发酵植酸酶的条件优化研究.docVIP

毕赤酵母基因工程菌发酵植酸酶的条件优化研究 刘 林 刘明河 (临沂师范学院生命科学学院,山东临沂 276005 [摘 要 ]Pichiapastoris 能使外源真核基因正确翻译和翻译后加工,并能对许多蛋白质产物进行分泌,使产物易于提纯,是一种极具潜力的 酵母表达系统 。 以毕赤酵母基因工程菌为实验菌种,探索其在不同条件下的产植酸酶情况,优化发酵条件,找出高密度生长及高效产酶的最 佳条件,从而降低生产成本 。 [关键词 ]Pichiapastoris ;酵母表达系统;植酸酶;发酵条件 植酸酶能将植酸降解成肌醇或磷酸肌醇和磷酸,是一种优良的食 品和饲料添加剂,可消除单胃动物因不能分解植酸而引起的抗营养作 用,提高机体对蛋白质及多种微量元素的利用率,具有良好的饲喂效 果,同时,降低了磷对环境的污染 。 植酸酶真正具有开发价值的仅限于 微生物经发酵生产植酸酶 。 国外对植酸酶的研究已有 30多年的历史, 但由于天然来源的植酸酶或者提取困难,或者分泌量太低,或者成本太 高,难以满足生产的需要,由此构建基因工程菌,获得能高效表达植酸 酶的菌株,成为解决这一问题的途径 。 巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris 是一种极具潜力的酵母表达系 统,它能使外源真核基因正确翻译和翻译后加工,并能对许多蛋白质产 物进行分泌,使产物易于提纯;同时,自 20世纪 70年代起建立的以 巴斯德毕赤酵母作为单细胞蛋白生产菌的高密度发酵方法已经成熟,以 毕赤酵母基因工程菌为实验菌种,探索其在不同条件下的产酶情况,就 能找出高密度生长及高效产酶的最佳条件,从而降低生产成本 。 1酵母细胞培养时 C 源的选择 由于一些重组蛋白对细胞有毒害作用,通常在大容量 、 高密度的 酵母培养过程中,需要在细胞扩增阶段用极高密度的抑制物来阻遏其他 表达系统,诱导前又需将之去除 。 而对于 P.pastoris 在生物量扩增阶 段,只需少量的抑制物 (通常为甘油 ,既可以满足细胞生长,又能有 效地抑制外源基因的表达;在表达阶段,让细胞耗尽剩余的甘油,再加 入甲醇诱导产酶 。 下面就加入甘油和甲醇的浓度对菌体生长 、 产酶的影 响进行分析 。 1.1不同甘油浓度对生长的影响 (图 1 在 36hr 之内, 2.5%和 4%甘油浓度下菌体的生长曲线是相似的 。 36hr 之后,含 4%甘油的菌体 OD 值却超过了含 2.5%甘油的 OD 值, 但两者差别并不大,说明在该条件下仍然存在限制菌体生长的其他因素 妨碍其浓度提高 。 分析结果可知,细胞到达表达阶段时,含 4%甘油的 培养基中残存的甘油很多,而甘油的存在限制了外源蛋白的表达,对菌 体产酶产生了一定的影响 。 图 1甘油浓度对生长的影响 1.2不同甘油浓度下甲醇的浓度对于产酶的影响 (图 2、 3 由图 2可知,在 0.8%较低甘油浓度下, 0.15%浓度的甲醇对于产 酶较为有利,酶活可达到 700U /mI 。 而相比之下, 0.05%、 0.3%浓 度的甲醇下酶活较低 。 由图 3可知,在 3%较高甘油浓度下, 46、 82hr 时酶活到达高峰期,其他时间酶活较低 。 而且,在较高浓度的甲醇 (0.3% 下,酶活比 0.05%、 0.15%浓度的甲醇要高 。 同时对比图 2和 3可知,产酶在 0.8%较低甘油浓度下要高于 3%较高浓度 。 图 20.8%甘油下甲醇对产酶的影响 图 33%甘油下甲醇对产酶的影响 2氮源对菌体生长及产酶的影响 添加氮源的目的是为了凋节碳氮比,满足菌株的快速生长及产酶 的需要 。 本实验是在 4%的甘油浓度下 。 加入不同的氮源,使含氮量为 0.2%,同时做一个空白对照 。 培养 60hr ,测 OD 值; 72hr 测酶活,结 果见表 1 : 由表 1可知,玉米浆 OD 值最高,表明菌体长得最好;而对于产 酶,以 (NH 2SO 4的酶活最高 。 因此视为该试验发酵最有利的氮源 。 3pH 对菌体产酶的影响 在发酵过程中,定时检测发酵液的 pH 值,发现随着发酵时间的延 长 . pH 逐渐下降 。 当菌体基本上将 1%甘油耗尽时,添加不同量的甲 醇,并调节不同的初始 pH 值,其对酶活的影响结果见图 4、 5。 由图 4、 5可知,添加 0.05%和 0.3%,的甲醇,初始 pH 为 3的发酵液产酶 均高于初始 pH 为 5.5的发酵液 。 由此可见, pH 为 3时对发酵液产酶较 为有利 。 图 40.05%甲醇下 pH 对产酶的影响 图 50.3%甲醇下 pH 对产酶的影响 4发酵工艺的优化 为了最大程度地提高菌体浓度值及酶活,需要筛选到合适的培养 基,因此设计了正交实验 。 确定甘油 、 (NH 2SO 4、 接种量 、 磷含量 四个因素,并以各因素的不同添加