微生物检测简介.ppt

食品微生物检验 2016.2.16 一、微生物检测工作的意义 据世界卫生组织估计，在全世界每年数以亿计的食源性疾病患者中，70％是由于食用了各种致病性微生物污染的食品和饮水造成的。2000年至2002年，中国疾病预防控制中心营养与食品安全所对全国部分省市的生肉、熟肉、乳和乳制品、水产品、蔬菜中的致病菌污染状况的监测结果表明，微生物性食物中毒仍居首位，占39.62％；化学性食物中毒占38.56％；动植物性和原因不明的食物中毒均占10％左右。 传统的微生物检测方法，主要包括形态检查和生化方法，涉及的实验较多、操作繁琐、需要时间较长、准备和收尾工作繁多。 1955年德国学者F.J.Forg 发明了一种简单快速的大肠菌群快速检测法—纸片法，使原来的检测周期由72小时缩短到15小时，材料成本降低了四分之三，同时大大简化了操作程序。从此，这种生化检测方法开始发展起来。 另外，将培养基固化在试剂盒中的速测盒法，也是一种较为简洁快速的检测方法，省去了大量的实验准备工作。 二、开展微生物检测所需的基本条件 无菌室（含紫外灯等消毒设备的隔离空间）； 恒温培养箱； 微生物检测设备、器皿、试剂等； 高压灭菌锅；（灭菌是否彻底） 具备以上设备和无菌操作概念即可进行检测了。 灭菌彻底与否指示 灭菌指示胶带（3M） 生物指示（嗜热脂肪芽孢杆菌 121.1℃） 紫外灯相关 强度：对室内空气的消毒，直接照射法：采用室内悬吊式紫外线消毒时，室内安装紫外线消毒灯（30Ｗ紫外灯，在1.0m 处的强度 70μW/cm2）的数量为平均每立方米不少于 1.5W，照射时间不少于30min。 更换频率：紫外线灯使用过程中其辐照强度逐渐降低，故应定期测定消毒紫外线的强度，一旦降到要求的强度以下时，应及时更换。 紫外线消毒灯的使用寿命，即由新灯的强度降低到70μW/cm2 的时间(功率≥30W)，或降低到原来新灯强度的 70%（功率 30Ｗ）的时间，应不低于 1000h。紫外线灯管有高硼玻璃和石英玻璃之分，由于高硼玻璃的UV254nm紫外线透过率只有50%左右，一般只有1000小时；石英是紫外线透过率最高的材料，普通石英可以透过UV254的80%以上，石英玻璃紫外线灯寿命一般大于6000小时，进口的紫外线灯可以到8000h以上，部分厂家可以达到1200小时。 紫外线强度计至少1年标定1次 。 紫外线辐照时间计算 照射剂量和时间：不同种类的微生物对紫外线的敏感性不同，用紫外线消毒时必须使用照射剂量达到杀灭目标微生物所需的照射剂量。杀灭一般细菌繁殖体时，应使照射剂量达到10 000μW.s/cm2；杀灭细菌芽孢时应达到100 000μW.s/cm2；病毒对紫外线的抵抗力介于细菌繁殖体和芽胞之间；真菌孢子的抵抗力比细菌芽孢更强，有时需要照射到600 000μW.s/cm2，但一般致病性真菌对紫外线的抵抗力比细菌芽胞弱；在消毒的目标微生物不详时，照射剂量不应低于100 000μW.s/cm2。辐照剂量是所用紫外线灯在照射物品表面处的辐照强度和照射时间的乘积。因此，根据紫外线光源的辐照强度，可以计算出需要照射的时间。例如，用辐照强度为 70μW/cm2 的紫外线表面消毒器近距离照射物品表面，选择的辐照剂量是 100 000μW.s/cm2，则需照射的时间是：100 000μW.s/cm2 ÷ 70μW/cm2 = 1429 s ÷ 60s ≌ 24min。 1、概念的理解 无菌是指物体中没有活的微生物存在。 防止微生物进入人体或物体的操作方法，称为无菌技术或无菌操作。 关键点： 人：操作前洗手更衣等 物：试剂器械 环境：无菌室 三、 无菌操作和注意事项 四、 革兰氏染色 　革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师、细菌学家 Christain Gram创立。 步骤： a. 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗。 b. 滴加革兰氏碘液，作用lmin，水洗。 c. 滴加95%乙醇脱色约15-30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。 d. 滴加复染液，复染lmin，水洗、待干、镜检。 原理：细菌先经碱性染料结晶紫染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（ Gˉ ）。　G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，番红染液复染后呈红色。 革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄球菌）、蜡样芽孢杆菌