生物制品制备一般步骤.pptVIP

1. Dot blot 2. Southern blot： DNA （五）PCR技术 1.基本原理 2.引物设计 1)长度; 2)GC%; 3)stem-loop; 4)dimer; 5)错配; 6)5’末端可以不配对。 3.应用: 科学研究；医学与兽医临床。 Kary B. Mullis La Jolla, CA, USA. B.1944 DNA生物合成与PCR方法合成DNA的异同点: 1.相同点：均为酶促反应；均需要模板和引物；底物为dNTP； 半保留复制；均为5’ 3’方向复制。 2.不同点： 1）反应条件不同：体内为生理条件，体外为94℃、52℃及72 ℃ 等变温条件； 2）参与反应的物质种类和数量不同； 3）引物不同，体内为RNA，体外为DNA，且在DNA合成后，前者 被切除掉，后者作为终产物的一部分； 4）体内为半不连续合成，体外为连续合成； 5）体内单复制原点或多复制原点，单方向或双方向复制； 6）体内受细胞周期的调控，体外按人们的意愿进行； 7）体内具有校正、修复的功能（错配率较低），体外无（错配 率较高）； 8）体内DNA的复制为全部染色体DNA的复制，体外仅复制两引物 之间的DNA序列。 四、基因工程中的工具 （一）载体 1.质粒(plasmid) 2.粘粒(cosmid) 3.λphage或其他病毒，如腺病毒、杆状病毒等。 （二）工具酶 1.限制性内切酶 2.外切酶 3.连接酶 4.聚合酶: klenow I 5.核酸酶 （三）宿主菌： DH5?, JM101, JM109, DE3等。 五、获得目的基因的方法 基因文库：基因组文库和cDNA文库； PCR； 化学合成。 还有DD-PCR以及基因芯片等技术。 应对获得的目的基因进行测序鉴定！ 六、重组质粒（表达载体）的构建与鉴定 1. DNA（载体和目的片段）的酶切与回收。 2. 目的片段与载体的连接。二者的摩尔比应满足以下 比例：粘端：3~5:1；钝端：6~8:1 3. 转化与重组质粒的筛选、鉴定。 1）初步鉴定：抗性；α-互补；快速鉴定；原位杂交；PCR。 2）酶切鉴定：大小和方向。 3）测序鉴定：双脱氧测序法。 七、基因导入技术 （一）细菌 1.氯化钙； 2.电穿孔技术。 （二）细胞 1.脂质体； 2.磷酸钙； 3.电穿孔； 4.显微注射； 5.Virus Vector。 （三）受精卵 1.显微注射； 2.电穿孔技术； 3.精子载体； 4.ESC； 5.Virus Vector（ RT-V or Lentivirus-V）。 八、常用表达系统 （一）原核表达系统：包涵体；分泌型。 已成功的基因工程产品绝大部分是利用原核系统生产的，如IFN、IL、TNF、G-CSF、GM-CSF等。 （二）真核表达系统：传代细胞，酵母，生物反应器等。 1. 传代细胞：如CHO、BHK、Vero、MDCK等； 2. 酵母：毕赤（甲醇）酵母； 3. 生物反应器：如乳腺、血液、尿液、鸡蛋、昆虫等。 世界上第一个动物（山羊）乳腺生物反应器产品—重组人抗凝血酶Ⅲ（商品名ATryn?）于2006年获准上市。由全球最著名的动物乳腺生物反应器研发企业——美国Genzyme转基因公司研制成功。 重组蛋白 动物 生产公司 LA,α-LA, 单抗, 溶菌酶, 牛 Advanced Cell Technology, Genetic GH, INS, HSA 牛 Savings and Clone,Infigen, Pharming ATⅢ,tPA,单抗,GH,α1-抗胰蛋白酶 山羊 Genzyme Transgenics,Nexia Biotechnologies,PPL therapeutics 纤维蛋白原表面蛋白B,原胶原重组抗体 小鼠 Abgenix,M