DNA体外重组和转化宿主细胞与其筛选检测工作.ppt

1）大肠杆菌感受态细胞的制备： 100ml菌体培养至OD600= 0.5，离心收集菌体 用10ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心收集菌体 用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体 冰浴放置12 - 24小时，备用。 2）重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞： 取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组DNA连接液，混匀 冰浴放置半小时 在42℃保温 90秒（热击） 快速将转化细胞转移至冰浴中放置15分钟 加入1 ml 新鲜培养基（无抗生素），于37℃培养1小时（扩增） 涂在合适的固体培养基（LB）平板上进行筛选 。 2、电击转化法 将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。 优点：操作简单，不需要制备感受态细胞，转化效率较高，达109-1010个转化子/1μgDNA。 参数设定： 电压：300-600V/cm 脉冲时间：20-100ms 温度： 0-4oC 温度较低使穿孔修复放缓，有利于DNA摄入细胞内。 重组DNA转入农杆菌： 1、三亲交配法 A、受体农杆菌LBA4404或4401（Rifr）。 B、起协助作用的大肠杆菌HB101（pRK2013）。 C、供体菌，带有中间表达载体的大肠杆菌（Kmr）。 辅助质粒pRK2013进入大肠杆菌内，提供游动 （mob）和转移（tra）功能，把重组质粒转移到农杆菌内。 2、点击转化法： 3、冷冻转化法 将重组DNA分子转到农杆菌中。 （二）阳性转化子的筛选和鉴定（检） 阳性转化子：即含有重组DNA分子的受 体细胞。 筛选方法：（1）抗药性筛选法 （2）蓝、白斑筛选法 （3）菌落原位杂交法 （4）酶切鉴定 （5）菌落PCR法 蓝白斑筛选的原理： X-gal+ IPTG（诱导剂） LacZ’的编码产物为β-半乳糖苷酶的α肽段（146aa），受体菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株，不能合成α肽段，但能合成β-半乳糖苷酶的β肽段。 菌落原位杂交的操作过程 （二）转化率 1、定义：指每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。 一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不生长）。 应用广泛的除草剂主要有： 草甘膦、草丁膦、阿特拉津等。 * 莽草酸-3-磷酸（S3P），5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸（EPSP）。芳香族氨基酸参与植物体内一些生物碱、香豆素、类黄酮、木质素、吲哚衍生物、酚类物质等的次生代谢。 * 具有使草丁膦代谢失活的作用，其作用机理是在乙酰辅酶A存在的情况下，乙酰辅酶A转移酶催化乙酰辅酶A与草丁膦的游离氨基结合，形成乙酰-L-草丁膦，从而失去除草剂活性。 * 在高等植物中，甜菜碱由胆碱经两步氧化反应合成，分别由 CMO 和 BADH 催化。在哺乳动物和一些微生物如大肠杆菌 Escherichia coli 中， 则由 CDH催化胆碱形成甜菜碱醛，再由 BADH 催化合成甜菜碱。一些微生物如球形节杆菌胆碱可不经过甜菜碱醛而在胆碱氧化酶 COD的催化 下直接生成甜菜碱。 * 3-磷酸甘油酸（3-PG） * 而非跃变型果实成熟过程比较缓慢，上述的各种变化缓慢渐进的，不像跃变型果实那么急速。 * 异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）---β-半乳糖苷酶活性诱导剂，其作用与半乳糖相似，在大肠杆菌乳糖操纵子中作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。 * 基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即α肽链） * * 转化率是衡量转化效率的重要指标， （六）控制果实成熟期的基因及其应用 1、调控果实成熟的意义： 番茄、香蕉、苹果、葡萄、草莓、菠萝、荔枝、龙眼等在贮藏和运输过程中，由于成熟过程迅速，很难控制，常导致过