第十三章-基因工程.pptVIP

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2019-12-12 发布于福建
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第十三章-基因工程.ppt

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作为载体的DNA分子有质粒DNA，噬菌体DNA，粘粒和病毒DNA等。它们经人为改造后在宿主细胞中只具有自我复制能力的DNA为克隆载体；质粒：是存在于细菌染色体外小型双链环状DNA，能在宿主细胞中独立地复制，并在细胞分裂时传递给子代细胞，其DNA分子上的基因对宿主细胞的代谢活动和抗药性的表型均有一定的作用。可赋予细菌特定的表型，如抗生素抗性，是筛选转化子细菌的遗传标志。为基础研究和应用研究的需要而分离获得的某一感兴趣的基因（DNA序列），或者是为得到某一感兴趣的蛋白质或RNA所对应的DNA序列。有两种类型，既cDNA和基因组DNA。直接选择法：抗药性选择、分子探针、标志补救（如α-互补筛选）。免疫学方法：利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行的筛选（如酶免检测分析）。第三节重组DNA技术的基本过程制备目的基因和相关载体。将目的基因和载体进行体外连接。将重组的载体DNA导入宿主细胞。 DNA重组体的筛选和鉴定。 DNA重组体的扩增表达。结束放映返回目录载体 + 重组子转化或转染目的DNA 细菌重组DNA增殖筛选含重组质粒的细菌（以质粒为载体的DNA克隆过程）结束放映返回目录阳性克隆的筛选及扩增一、目的基因的获取 1、从基因组DNA中分离获得 2、从基因文库中筛选获得（基因组文库及cDNA文库） 3、化学合成法 4、PCR扩增 5、mRNA逆转录结束放映返回目录 1、从基因组DNA文库中筛选获得基因组DNA文库：分离组织或细胞染色体DNA，用限制性核酸内切酶将其切割成许多片段后将它们与克隆载体拼接成重组DNA，将所有的重组DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体称基因组DNA文库。结束放映返回目录 2、从cDNA文库中筛选获得 cDNA文库：将总mRNA逆转录生成cDNA，再复制成双链cDNA的混合体并与适当的载体进行拼接成重组DNA，使每一个cDNA分子只与一个载体分子拼接成重组DNA。将所有的重组DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体就称为cDNA文库结束放映返回目录 3、化学合成法用DNA合成仪合成所需要的目的基因片断。结束放映返回目录 PCR是一种在体外利用DNA聚合酶催化反应获得特异序列的基因组DNA或cDNA的技术。 4、PCR法：二、目的基因与载体的连接粘性末端连接利用人工接头连接加入同聚体尾连接结束放映返回目录细菌质粒 CCGG GGCC HpaII CGG C C GGC CCGG CCGG GGCC GGCC 哺乳动物DNA片断 HpaII CGG C C GGC + 混合、DNA连接酶催化细菌质粒与哺乳动物DNA片断共同构重的重组质粒 (同一限制酶切割DNA粘性末端的连接) CCGG GGCC CCGG GGCC 结束放映返回目录结束放映返回目录 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 载体DNA+dGTP 目的DNA+dCTP 末端脱氧核苷酸转移酶 3’ 3’ 3’ 3’ PolyG PolyG PolyC PolyC PolyG PolyC 同聚物加尾连接法三、重组DNA导入宿主细胞常用的方法有以下几种：（一）转化（二）感染（三）转染结束放映返回目录选择适当的宿主细胞，处理使之成为感受态细胞，然后导入重组DNA。四、目的基因的筛选和鉴定（见前DNA文库的筛选）结束放映返回目录举例：以质粒PBR322为载体的目的基因DNA克隆过程结束放映返回目录细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养含重组体pUC18的白色菌落蓝色菌落细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养含载体pUC18的蓝色菌落重组体pUC18 转化 (利用 ? 互补原理筛选重组子Puc18) 多克隆位点