SYBR+Green+I荧光定量PCR检测乳中携带sea基因金黄色葡萄球菌的研究.docVIP

※生物工程 食品科宇 ２００８，Ｖ０１．２９，Ｎｏ．０７２３５ ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ 荧光定量ＰＣＲ检测乳中 携带ｓｅａ基因金黄色葡萄球菌的研究 李一松，王明娜，吕琦，张光辉，闫冰，相丽，姜毓君幸 （乳品科学教育部重点实验室，东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 １５００３０） 摘要：金黄色葡萄球菌是引起食物中毒的一种常见的致病菌，而其产生的肠毒素Ａ是乳及乳制品食物中毒事件 Ｇｒｅｅｎ 的主要原因。本研究建立了ＳＹＢＲＩ荧光定量ＰＣＲ方法对乳中携带ｓｅａ基因的金黄色葡萄球菌进行检测。该 方法能快速、稳定地在８ｈ内完成对乳中金黄色葡萄球菌的检测，对人工污染乳中金黄色葡萄球菌检测的最低检出限为８３ＣＦＵ／ｍｌ。 关键词：金黄色葡萄球菌；荧光定量ＰＣＲ；乳；ｓｅａ基因；ＳＹＢＲＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ＧｒｅｅｎＩ ａｌ比ｒｅｕｓ Ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｓｅａ ｇｅｎｅｉｎ ＭｉｌｋｂｙＳＹＢＲＧｒｅｅｎ ＩＲｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ ＵＹｉ—ｓｏｎｇ，ＷＡＮＧＭｉｎｇ—ｎａ，ＬＵＱｉ，ＺＨＡＮＧ （Ｋｅｙｔ盘ｄ，ｏｒｔｏｒｙ ｏｆＤａｉｒｙ Ｇｕａｎｇ—ｈｕｉ，ＹＡＮ Ｂｉｎｇ，ＸＩＡＮＧＬｉ，ＪＩＡＮＧＹｕ－ｊｕｎ? Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ。 ＮｏｒｔｈｅａｓｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００３０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ａｔｅａｌ．ｔｉｍｅＰＣＲ ａ ｍｅｔｈｏｄｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙＳｔａｐｈｙｌｏｃｂｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｓｅａ ｇｅｎｅｕｓｉｎｇ ＰＣＲｍａｓｔｅｒｍｉｘｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＤＮＡ—ｂｉｎｄｉｎｇｄｙｅＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ．ＴｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅＣａｎｂｅａｃｈｉｅｖｅｄｆｏｒｍｉｌｋｓａｍｐｌｅｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄｂｙＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ ｗｉｔｈｉｎ８ｈ．ａｎｄｔｈｅｌｉｍｉｔｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｓ８３ＣＦＵ／ｍｌｍｉｌｋ． Ｉ；ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ Ｋｅｙｗｏｒｄｓ．Ｓｔａｐｈ）’ｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ；ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ；ｍｉｌｋ：ｓｅａｇｅｎｅ； 中图分类号：ＴＳ２０１．２１文献标识码：Ａ文章编号：ｌ００２－６６３０（２００８）０７—０２３５－０５ 金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｒｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）是引起食物中毒的一种主要的致病菌。据美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒仅次于大肠埃希氏菌，居第二位，占细菌性食物中毒的３３％。金黄色葡萄球菌能产生多种毒素，有肠毒素（ＳＥＳ）、剥脱毒素（ＥＴｓ）和中毒休克毒素（ＴＳＳＴ．１）等。其中肠毒素是引起金黄色葡萄球菌食物中毒的主要原因，它是一类结构相关、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白质【１ｌ，除了ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ、ＳＥＤ、ＳＥＥ等５种早已被鉴定的血清型外，近几年还报道了ＳＥＧ、ＳＥＨ、ＳＥＩ、ＳＫＪ、 ＳＥＫ、ＳＥＬ、ＳＥＭ、ＳＥＮ和ＳＥＯ、ＳＥＰ、ＳＥＱ、ＳＥＲ、 条件下经过３０ｍｉｎ仍保持致病能力，这使其能够耐受原料乳的热加工处理，因此针对ＳＥＡ的检测具有尤为重要 的意义。 荧光定量ＰＣＲ技术具有灵敏度高、特异性强、能实现多重反应、准确性高和具实时性等优点，可克服现有免疫学检测方法（如ＥＬＩＳＡ）不足，并且已成功应用于食品中致病菌的检测。本研究针对携带ｓｅａ基因金黄色葡萄球菌的人工污染牛乳，采用ＳＹＢＲ 敏度。 １ ＧｒｅｅｎＩ染料法 进行荧光定量ＰＣＲ检测，并确定检测方法的特异性及灵 ＳＥＴ、ＳＥＵ等新分型的肠毒素【ｚ．３】，其中Ａ型的毒力最强，摄入１ １１ 材料与方法材料 ｇ即能引起中毒。同时，该肠毒素能在１００℃ １．１ 收稿日期：２００７．１０．１０ 基金项目；国家科技支撑计划项目（２００６ＢＡＤ０４Ａ０８）；黑龙江省科技攻关重大项目（ＧＡ０６Ｃ１０１．０８）； 黑龙江省高校青年学术骨干项目（１１５１Ｇ００６） 作者简介：李一松（１９８２．），男，硕士研究生，研究方向为食品微生物与生物技术。Ｅ．ｍａｉｌ：ａｂｎｅｒ—ｌｅｅ＠１６３．ｃｏｒｎ?通讯作者：姜毓君（１９７１．），男，教授，博士，研究方向为食品微生物与生物技术、食品质量与安全。 Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｊｕｎ＿ｊｉａｎｇ＠ｎｅａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 万方数据　 ２３６ ２００８，ＶｏＬ２９，Ｎｏ．０７ 目晶科学 ※生物工程 １．１．１菌株实验菌株共１３株（见表１），其中３株为美国典型培养物保藏中心标准菌株（ＡＴＣＣ），１