基因实验步骤.docVIP

一 基因组DNA的提取—苯酚抽提法 1.冻存血样室温融化，吸取500ul血液加入2.0ml的灭菌离心管内。 2.向离心管内加入1.5ml的PBS缓冲液，颠倒摇匀10min，12000rpm 4℃离心10min。 3.弃去上清液，重复上一步骤1-2次（加液后可轻弹管壁使沉淀脱离，直至出现白色沉淀止）。 4.弃去上清液，加入500ul DNA抽提缓冲液，摇动使沉淀脱离管壁。 5.加入Pr酶k10ul（20ul/ml），吹打混匀，55℃，水浴过夜（16-18h，消化过程中可不时轻轻摇匀反应液）。 6.反应液冷却至室温后，加入Tris-平衡酚500ul，摇动混匀20min，12000rpm 4℃离心10min。 7.取上清液移至另一2.0ml的灭菌离心管内，加等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），颠倒混匀20min，12000rpm 4℃离心10min。 8.取上清液移至另一2.0的灭菌离心管内，加等体积氯仿：异戊醇（24:1），缓慢颠倒离心管20min，12000rpm 4℃离心10min。 9.轻轻取上清液移至另一1.5ml的灭菌离心管内，加2倍体积的无水冷乙醇（-20℃），轻轻上下颠倒混匀，冰浴10-20min，可见DNA沉淀，12000rpm 4℃离心10min。 10.弃去上清液，沉淀用1ml 70%乙醇吹打洗涤，12000rpm 4℃离心10min。 11. 弃去上清液，室温晾干。加入50ml TE溶解DNA，-20℃保存。 二 DNA浓度与纯度的检测 琼脂糖凝胶电泳检测。 取2uL待检NDA溶液和3uL加样缓冲液混匀，在2.0%的琼脂糖凝胶。根据电泳槽的长度确定合适的时间，一般5 V/cm，紫外灯下观察电泳结果，并拍照保存。 用分光光度计检测DNA浓度。 吸取5uL样品，加超纯水3mL混匀，移入分光光度计的比色杯中。用3mL超纯水校正零。在260nm和280nm分别读出光密度。用OD260/OD280的比值估测纯度，比值大于1.8时，有RNA，应用RNA酶处理；比值小于1.6，有酚或者蛋白，应再次抽提。 三 基因组DNA的除蛋白纯化 1.50Oul的DNA溶液中加入20%SDS使其终浓度为0.1%，加入蛋白酶K至终浓度达到1O0ug/ml。 2.55℃保温10h左右。 3.用等体积苯酚、苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)和氯仿分别抽提一次，12000rpm 4℃离心10min。 4.分相后，吸取上层水相移入另一离心管中。 5.加入2倍体积冰冷无水乙醇（-20℃）沉淀DNA，12000rpm 4℃离心10min。 6.弃去上清液，DNA沉淀70%乙醇洗涤一次，12000rpm 4℃离心10min。 7. 弃去上清液，室温晾干。加入50ml TE溶解DNA，-20℃保存。 四 基因组DNA的除RNA纯化 1.DNA溶液中加入20mg/mlRNaseA使终浓度达到50ug/ml，37℃保温30min。 2. 用等体积苯酚、苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)和氯仿分别抽提一次，12000rpm 4℃离心10min。 3.分相后，吸取上层水相移入另一离心管中。 4.加入2倍体积冰冷无水乙醇（-20℃）沉淀DNA，12000rpm 4℃离心10min。 5.弃去上清液，DNA沉淀70%乙醇洗涤一次，12000rpm 4℃离心10min。 6.弃去上清液，室温晾干。加入50ml TE溶解DNA，-20℃保存。 五 引物设计与合成 参考魏伍川对牦牛FSHR基因5’端的测序结果进行引物设计，设计好的引物送生物公司合成。引物设计如下： 引物 碱基数 序列（5’至3’） 扩增区域 引物1 267 GAAAGGACATGCGACAG FSHR5’端 CCTCCAGGCTACTTGATA 引物2 332 GTAGCCTGGAGGAAGACA FSHR5’端 CTCCCAGACAAATAGCAGA 引物3 372 TCTGCTATTTGTCTGGGAGT 第1外显子 GCCACGCTGTTGTTCC 六 引物溶液的配制 将引物管进行瞬间离心，加入（公司DNA合成报告单上的nmol数 X10）ul灭菌双蒸水，配制成100u M的浓度，充分振荡5-10min，在4℃放置24小时，使其充分溶解，然后再稀释成实验浓度10 uM。 七 建立最佳的PCR反应体系与反应条件 PCR的反应体系如下表： 反应体系成分(浓度) 体积(单位: ul) 模板