基因工程 实验报告.pdfVIP

基因工程实验报告 学号 姓名 1 实验目的 （1）学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA 的提取方法。 （2 ）学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA 的原理和方法，检测质粒DNA 的浓度与分子量。 （3 ）了解PCR 的基本原理，掌握PCR 的基本操作技术。 （4 ）学习利用限制性内切酶切割DNA 的方法，并通过电泳检测酶切的效果。 （5 ）学习DNA 重组技术中的核心步骤，DNA 片段之间的体外连接方法。 （6 ）学习制备感受态细胞并将体外重组DNA 引入受体细胞的技术。 （7 ）掌握利用蓝白斑筛选出转化子的方法。 2 实验原理 2.1 质粒DNA 提取的原理 菌体在NaOH 和SDS 溶液中裂解时，双链DNA 氢键断裂，DNA 双螺旋结构遭破坏而 发生变性，但由于质粒DNA 分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH 条 件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液调时，变性质粒DNA 又恢复到原来 的构型；而线性的大分子量的细菌染色体DNA 则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS 等 形成不溶性复合物。当加入中和溶液后，质粒DNA 能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留 在上清中；变形的蛋白质和 DNA 呈絮状，离心时可以沉淀下来。碱裂法获得的质粒 DNA 经过苯酚、氯仿抽提，RNA 酶消化和乙醇沉淀除去残余的蛋白质和RNA，所得纯化的质粒 DNA 可满足实验要求。 2.2 PCR 扩增功能基因的原理 将反应体系(模板DNA、引物1、引物2 、Mg2+ 、4 种dNTP 和Taq DNA 聚合酶)置于 高温(94℃)下变性，使模板双链DNA 解链为两条单链。在低温(37~65℃)下退火，使引物与 模板链3’端结合，形成部分双链DNA 。在中温(~72℃)下，通过Taq DNA 聚合酶使引物从5’ 端向3’端延伸，随着4 种dNTP 的掺入合成新的DNA 互补链，完成第一轮变性、退火和聚 合反应循环。反复进行这种变性、退火和聚合反应循环，可使两端引物限定范围内的 DNA 序列以指数形式扩增。循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上将一个目的DNA 分子 6 经20 轮扩增后，可达10 。 2.3 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 含量的原理 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶 孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA 分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向 正极泳动。DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分 子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分 离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。 SYBR Gold 与DNA 结合的亲和力高，且结合后能够极大的增强荧光信号。SYBR Gold 染料的最大激发波长为495nm，在300nm 有第二个激发峰，其发射的荧光波长为537nm。 2.4 DNA 的体外连接 DNA 连接酶催化两个双链DNA 片段5’端磷酸和3’端羟基之间形成磷酸二酯键。 2.5 氯化钙制备感受态和转化大肠杆菌原理 把外源 DNA 分子导入到某一宿主细菌细胞的过程称为转化(transformation) 。当细菌处 于容易吸收外源DNA 的状态即感受态时，转化最易发生。常用的转化方法是用CaCl2 处理 受体菌，使细菌细胞进入敏感的感受态。当细菌处于冰冻(0℃) 的CaCl2 溶液中，细菌细胞 膨胀成球形，转化混合物中的DNA 形成抗DNase 的羧基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面， 经42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收外源DNA 。 2.6 蓝白斑筛选重组质粒原理原理 lacZ 编码β-半乳糖苷酶，受lac 启动子调控，当E.coli 菌株表达lac 阻抑物，则载体上 的lacZ 基因由IPTG 诱导表达，表达形成的酶可以利用X-gal 形成蓝色化合物。重组质粒中 lacZ 插入失活导致不能形成蓝色菌落。 3 实验试剂及设备 3.1 实验设备 台式离心机、旋涡振荡器、恒温水浴锅、微波炉、电泳仪、电泳槽、凝胶成像检测仪 、 超净工作台、 冰箱