基因实际操作主要技术应用基本原理.pptVIP

Directed evolution （直接进化或定向进化） 对目的基因人为制造大量突变，然后按照特定的需要和目的，给予选择压力，将满足要求的、适合特定目的的分子筛选出来，从而实现在试管中分子水平的模拟进化。 三、基因的直接进化技术 Key steps of a typical directed enzyme evolution experiment 突变 基因突变库的建立 筛选：基因突变库的活体或离体筛选 随机突变的策略： 1. 易错PCR（error-prone PCR） 在扩增目的基因的过程中，通过改变PCR反应的条件（如改变4种dNTP的比例、改变Mg2+的浓度等），在PCR过程中引入碱基错配，导致目的基因的随机突变 2. DNA shuffling （DNA 重排或改组） 指DNA分子的体外重组,是基因在分子水平上进行有性重组。通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能 基本步骤: 目的基因片段的准备：根据不同的需要选择一个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同源性的基因 DNaseI酶切：将基因随机切割成约50～100bp左右的小片段 不加引物的PCR：在Taq酶的作用下将切割后的DNA重叠小片段重新连接起来，在这个过程中可能发生许多突变和重组 加引物