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新城疫病毒（NCV）荧光定量RT-PCR 检测试剂盒操作手册（第一版） 适用于各种食品类材料、卫生 监督、疾病控制等来源的临检样品 2006.12 深圳易瑞生物技术有限公司 试剂盒组成 产品目录号 规格 48次检测 新城疫病毒RT-PCR一步法反应液 1080μl / 1管 逆转录酶（5U/μl） 24μl / 1管 Taq酶（5U/μl） 20μl / 1管 新城疫病毒阳性对照 100μl / 1管 新城疫病毒阴性对照 100μl / 1管 操作手册 1份 注：本试剂盒不包括新城疫病毒RNA提取试剂，用户可采用通用型病毒RNA提取试剂盒或试剂盒推荐的提取方法。 产品介绍 本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术，用于禽肉、禽类组织脏器、禽类排泄和分泌物，及其泄殖腔和咽喉拭样中的新城疫病毒的检测。符合行业标准SN/T 1686-2005《新城疫病毒中强毒株检测方法：荧光RT-PCR法》的检测要求。 检测灵敏度：对于接种的鸡胚尿囊液，检测的最高稀释度可达10-8～10-7，与鸡胚病毒分离方法的灵敏度接近。定量检测线性范围可达10-1010拷贝/ml。 特异性：本试剂盒根据新城疫病毒的fusion protein基因最新DNA序列设计，并通过系统验证，能够检测所有已知新城疫病毒毒株。对于其它禽类感染因子，本试剂盒检测结果为阴性。 贮存与运输条件 本试剂盒必须在-20℃下避光保存，有效期为6个月。 需在低温下运输。 注意事项 本试剂盒仅用于体外检测使用，操作人员必须经过培训并具有一定的经验，试剂盒使用前请仔细阅读说明书全文。 请严格按照基因扩增检验实验室的管理规范进行实验操作：如PCR实验严格分区操作；各区应有专用的手套、移液器等，不得交叉使用，避免污染；工作人员应遵循从一区到二区的单方向工作原则，各工作区相对隔离；进行PCR实验的工作桌面和及相关物品应定期用1%次氯酸钠、75%酒精、1mol/L盐酸或紫外灯进行灭菌和消毒。 所用的吸头和离心管都需要经DEPC水处理，以灭活RNA酶，75%乙醇也要用DEPC处理过的水配制。 试剂盒中各试剂充分融化后请短暂离心。反应液分装时应尽量避免产生气泡。上机前应注意检查各反应管是否盖紧，以免污染仪器。 适用荧光PCR仪品牌与型号 Cepheid公司的SmartCycler ABI公司的Prism7000、7700、7500、9600系列 Stratagene公司的MX3000、MX4000 Corbett Research公司的Rotor-Gene 3000 Bio-Rad公司的iCycler系列、MJ opticon2 Roche公司的LightCycler等 实验操作步骤 RNA提取：用户可采用通用型病毒RNA提取试剂盒提取新城疫病毒RNA用于检测或保存于-20℃（ 扩增试剂准备（在试剂贮存和准备区完成） 从试剂盒中取出RT-PCR一步法反应液，冰盒上融化后混匀，取出Taq酶和逆转录酶。试剂在使用前2000rpm离心20s。 设需要的PCR反应管管数为N（N = 待检样本数X份 + 1管阴性对照 +1管阳性对照）。 MIX的配制：首先吸取反应混合液至1.5ml灭菌离心管，体积22.1×N (μl)，再加入Taq DNA聚合酶0.4×N (μl)和逆转录酶0.5×N (μl)到1.5ml灭菌离心管，混匀后短暂离心（2000rpm/20s），然后向N 个0.2ml PCR反应管中分装已加入Taq酶和逆转录酶的MIX各23μl/每管，盖紧管盖。每个测试反应体系配制为：PCR反应液22.1μl+0.4μl Taq酶+0.5μl逆转录酶。 注意：阴性对照管建议在此区中加入2μl阴性对照样品。 加样（在样品制备区完成） 阳性对照取出解冻，使用前2000rpm 离心20s。 若样本提取物保存在-20℃，则在使用前置室温解冻；向N个PCR管中分别加入待检样本RNA（包括阳性对照）2μl，盖紧管盖，2000rpm离心20s，将PCR反应管转移至核酸扩增区。注意做好样品号标记。 PCR扩增（在核酸扩增区完成） 上机前应检查各反应管是否盖紧。 反应体系设为25μl；荧光信号采集设定在退火温度。对于多通道荧光PCR仪，选择荧光素FAM为信号采集通道。 PCR循环参数为：第一阶段，50℃ 30 min反转录 第二阶段，95℃ 第三阶段，[95℃ 10s；60 质量控制标准及结果判断 阴性对照CT值应显示为0或≥40.0，阳性对照的CT值应≤30.0，否则视实验失败，需重做。 检测样品CT≤35.0，结果有效，可直接报告样品阳性； 检测样品35.0CT40.0，需进行一次重复实验，若CT仍介于35.0和40.0之间，且曲线有明显的指数增长特性，同时阴性对照Ct值为零，可报告样品阳性