电镜酶细胞化学技术-七年制.pptVIP

电镜放射自显影法 电镜免疫组织和细胞化学 电镜X线微区分析 糖类、脂类和酶类电镜细胞化学  电镜酶细胞化学 ( electron microscopic  enzyme cytochemistry ) 在电镜下通过酶的特异细胞化学反应，显示酶在细胞内定位的方法。 *一、电镜酶细胞化学的基本步骤 1.取材和固定： 取材:以1mm×1mm×2mm大小为宜。取材要快。最好采用全身灌流或单一器官灌流的方法，能较好地保存酶的活性及定位准确。 固定:固定剂要做到既保持酶活性，又保持细胞的超微结构。 4%多聚甲醛－0.5%戊二醛混合液 (用二甲砷酸钠缓冲液配制） 根据酶反应的特性来选择固定液。 固定时间因酶的种类而异，几min至几十h。 2.固定后漂洗：目的是去除醛类固定液。 　　0.1mmol/L二甲砷酸钠缓冲液(pH7.4)， ４℃，2h或过夜。 3.预切片：采用恒冷箱切片或振荡切片，厚度为40～70μm。 4.预孵育:目的是置换缓冲液。 将预切片置于无底物的孵育液内，20℃,30min; 用配制孵育液的缓冲液冲洗，4℃，２～３次， 5～10min/次。 5.孵育： 原理： 　　 酶分解 　　 捕捉剂 底物→→→初级产物 →→→→不溶性终产物 在振荡式恒温（37℃）水浴箱中进行。 孵育时间长短因不同实验而定(应边孵育边在光镜下检查) 。 6.孵育后漂洗： 　目的是去除残留物，尤其是铅离子。 　 　*先用配孵育液的缓冲液漂洗， 4℃，２～３次，５min/次； 　　*再用0.1mmol/L二甲砷酸钠缓冲液漂洗， 　　　4℃，２～３次; ５min/次。 7.后固定：1%锇酸，4℃，１h。 8.脱水及包埋：乙醇、丙酮系列脱水；环氧树脂包埋。 9.超薄切片：取厚切片表面酶反应充分的部分，切片厚度为70～90nm，用镍网或金网捞片。 10.电子染色：注意要排除染色对细胞化学反应产物的干扰后，再进行染色(可单染或不染色) 。 二、常见的酶及其在细胞中的定位 　 酸性磷酸酶——溶酶体 碱性磷酸酶——细胞膜 ATP酶——细胞膜 葡萄糖-6-磷酸酶——内质网 琥珀酸脱氢酶——线粒体内膜、嵴 单胺氧化酶——线粒体外膜、嵴 细胞色素氧化酶——线粒体 过氧化氢酶——微体 焦磷酸硫胺素酶——高尔基体 髓过氧化物酶——粒细胞及单核细胞内质网、 核膜、高尔基体 乙酰胆碱酯酶——内质网、核膜、突触间隙 5-核苷酸酶——质膜 三、电镜酶细胞化学的注意事项 固定液的纯度：戊二醛需用活性碳处理纯化2～3次，4℃保存。 孵育液：孵育液的成份比例要严格。配制的试剂要用化学纯(GR)或分析纯(AR)。最好是进口试剂。要现用现配，按配方顺序加入各试剂，并随时搅拌；用新鲜双蒸水配制；使用前经双层滤纸过滤, 配好后调整pH值。 孵育对照： 　　1. 孵育液中去除底物。 2. 孵育液中加入底物抑制剂。 3. 使酶失活或加入酶活性抑制剂。 4. 用酶活性激动剂。 　孵育后标本处理： 后固定时间要小于1h，以免组织变脆；脱水时间要缩短；电子染色前要先观察未染色的切片，确定有无干扰。 所用器皿要清洁干净，避免和金属接触。 电镜Ｘ线显微分析技术 electron microscopic X-ray microanalysis 利用电镜中具有一定能量的细聚焦电 子束轰击生物样品的某一微小区域，使其 内部各元素分别激发出不同波长或不同能 量的特征X线。 通过检测特殊X线的能量和波长来确 定微区中元素的性质，进行定性分析；通 过检测特征X线的强度来确定微区中各元 素的含量，进行定量分析的技术。 一、基本原理 (一)X线的产生： X线是1895年伦琴发现的波长范围0.1～100?的电磁辐射，分为特征X线和连续X线。 1.特征X线 入射电子轰击样品，使其原子内壳层发生电离产生空位，由外壳层电子填补空位时，以辐射的形式释放出来的能量称为特征X线。 特征X线产生过程与条件 基态:在正常情况下核外电子首先占据低能级的壳层，这时原子的能量最低，处于稳定