赛拓实时荧光定量pcr讲座版.pptVIP

* * 阳性参比荧光 以固定的浓度存在于PCR Master Mix中，不参与扩增，信号强度只与取用多少有关。 校正方式：Rn = RReporter/ RROX 作用：消除用枪操作误差、管盖厚度等光学误差，减少孔间、批间差异，提高数据重现性和精确度。 * * TaqMan数据的ROX校正效果 * * 实时定量PCR数据处理 * * 绝对定量和相对定量的定义 绝对定量 目的是测定未知样品的准确拷贝数或浓度，需要已知准确拷贝数或浓度的标准品，需要制作标准曲线，数据处理比较方便，容易理解。 相对定量 不需要测定未知样品的准确拷贝数或浓度，只需要知道样品之间的浓度比值。所以，标准品可以是已知准确拷贝数或浓度的标准品，但是，最常用的方法是通过稀释目的基因的PCR产物作为标准品；标准品可有可无。数据处理相对复杂，比较难理解。 * * 绝对定量数据处理举例 * * 标准曲线法相对定量举例 * * 标准曲线法相对定量举例 目的基因 (pg total RNA) 目的基因的相对表达量（内参校正前） 内参 (pg total RNA) 目的经内参校正后的相对表达量 相对于0小时时目的基因的表达量（内参校正后） 0hr 1032 1 52,152 2.0x10-2 1 2hr 2320 2.25 45,123 5.1x10-2 2.55 24hr 404 0.39 80,176 0.50x10-2 0.25 * * △△CT法相对定量举例 △△CT的定义 △△CT=（CT未知样品- CT未知样品内参）-（ CT基准样品- CT基准内参） * * 比值与△△CT的关系 引入内参校正后 平均相对含量=2-平均△△CT * * △△CT法举例 目的基因 平均CT 内参 平均CT 内参校正. ( ΔCT) .与基准比较 (ΔΔCT) 比值 2- (ΔΔCT) 0Hr 24.5 12.6 11.9 0 1 2Hr 23.2 12.5 10.7 -1.2 2.3 24Hr 25.4 11.6 13.8 1.9 0.27 * * 常见问题及解决方法 * * 问题一：定量PCR无扩增曲线 可能原因一：DNA模板质量不好，含有抑制剂。 解决办法：DMSO，SDS和甲酰胺等有机试剂会抑制Taq酶的活性。如果怀疑模板含有抑制剂，需要进一步纯化DNA，提高模板质量。 可能原因二：引物探针设计较差。 解决办法：按照引物探针设计原则，重新设计并合成引物探针，对 探针序列进行blast比对，确保其特异性。 可能原因三：引物探针合成质量较差。 解决办法：用普通电泳法，观察是否有目的条带出现。确保探针荧 光报告基团和荧光淬灭基团的存在，可以用DNase处理TaqMan 探针，检测荧光是否增强。必要的话重新合成引物探针。 可能原因四：模板浓度太低。 解决办法：浓缩模板，使模板浓度在104个拷贝左右，以便在25到 30个循环中获得CT值。 * * 问题一：定量PCR无扩增曲线 可能原因五：镁离子浓度太低。 解决办法：从3mM到10mM，进行一系列镁离子梯度反应，确定对于 每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。 可能原因六：引物浓度太低。 解决办法：为了精确测定引物浓度，测量OD260的数值，通过公式计算 浓度。最佳引物浓度一般在0.1μM和1.0μM之间。 可能原因七：退火温度太高。 解决办法：利用软件估算Tm值，降低退火温度，最好是进行退火温度 梯度实验，寻找最佳的退火温度。 可能原因八：反应体系中有不明物干扰。 解决办法：对任何实验样品和试剂，应采用无菌无酶的离心管进行分 装、保存和使用。 * * 问题二：阳性对照无扩增曲线 1. 确认对照 观察未知样品是否有扩增曲线，来判断是对照的问题还是体系的问题；有扩增曲线，说明是对照问题，否则，可能是体系问题。 2. 确认体系 参考问题一的解决