实验 亲和层析纯化IgG.ppt

生物分离与纯化实验;持续改进 协作 实验报告： 1.信息栏填全，遗漏项：同组人员； 2.结果计算：过程完整 3.讨论分析不可缺项，内容丰满，见解细致。 ;实验（三）血清中抗体纯化（16学时）;配基 特异性 Protein A 许多IgGs 的Fc 片断 Protein G 许多IgGs 的Fc 片断 Antigen 特异的抗体 Anti-IgG 特异免疫球蛋白;低 pH下洗脱;;三、实验材料——纯化;缓冲液： 平衡液：20mM磷酸二氢钠，150mM氯化钠，pH7.2；(1L) 冲洗液：20mM磷酸二氢钠，0.5M氯化钠，10mM EDTA二钠，pH7.2；(1L) 洗脱液：0.1M Glycine-HCl，pH3.5；(1L) 清洗液：6mM氢氧化钠。(1L) 稀释血清： 取2ml血清，用平衡缓冲液稀释5倍，0.45um针头滤器过滤。标记为S.;三、实验材料——SDS;三、实验试剂——浓度测定;四、实验步骤;实验步骤1. Protein A纯化：;分离胶及浓缩胶的制备： 1 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O 冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干； 2 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照说明书提示装好玻璃板； 3 按以下配置10%分离胶及浓缩胶 ;;3、按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5 cm左右，之后加少许蒸馏水，静置30分钟。凝胶配制过程要迅速，催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 4、倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5 mm处，迅速插入样梳，静置10分钟。样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。 ;5、样品处理：还原样品：取30ul样品（S, W, E1 E2），加入30ul 还原上样缓冲液，100℃水浴5min，非还原样品加入30ul非还原上样缓冲液室温孵育5min。 6、加样：拔出样梳后，空出第一个孔，从第二个开始按已编排好的顺序依次加入相应体积的样品和蛋白Marker。其中S和Marker加样量为2 μl，W, E1， E2加样量为15 μl，还原与非还原样品间空一孔道。注射器不可过低，以防刺破胶体，也不可过高，在样下沉时会发生扩散。为避免边缘效应，???好选用中部的孔注样。;7、电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电压恒定在160 V，当进入分离胶后改为240 V，溴酚蓝距凝胶边缘约5 mm时，停止电泳。 8、凝胶板剥离与染色：电泳结束后，用专用工具撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，然后放在大培养皿内，加入染色液微波煮沸后，染色10min左右。剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分。 9、脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水冲洗染色液，再用微波煮沸后的脱色液脱色，可更换2次，直到蛋白质区带清晰。;实验步骤3. 蛋白质含量测定;;将凝胶至于薄板上（水润避免破损），并至于白色背景上，用直尺量取marker中各条带距离分离胶前沿的距离，以对应的分子量绘制分子量标准曲线： logMW=K-bX 以量取溶菌酶的迁移距离带入公式中计算分子量;分析抗体的纯度及分子量（还原，非还原） 计算抗体总蛋白得率。;下面开始实验！