生物化学实验技术应用柱层析.pptVIP

(三)　注意事项 　　1.　SPA-Sepharose CL-4B凝胶价格昂贵，可再生后反复使用10～20次左右。方法:先用10倍柱体积0.1M PH8.5 Tris含0.5M NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；再用10倍柱体积0.1M PH4.5醋酸钠缓冲液含0.5M NaCl液洗脱柱上残存的杂蛋白；0.1M PH8.0磷酸缓冲液平衡，4℃贮存。 　　2.　SPA-Sepharose CL-4B亲和层析法还可用于:(1)除去抗体液中IgG，检测非IgG抗体(如IgM)的生物学活性；(2)除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段； (3)回收或纯化免疫复合物。 　　3.狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。 ?中药露蜂房水溶性蛋白NV-PP-4的分离纯化及部分理化性质鉴定 1材料、试剂及仪器未经炮制的露蜂房生药；Gilson高压液相系统；Hermle Z 360K超速冷冻离心机；LKB紫外检测仪、Waters高效液相柱ProteinPakTM60；Zorbax ODS 300柱；Boehringer蛋白质分子量标准品；Beckman蛋白质等电点标准品；Pharmacia Sephadex G50，DEAESephadex A50；国产分析纯NaCI；国产色谱纯乙腈。 2分离纯化 2.1原料的提取露蜂房生药经剪碎后，置改良沙氏提取器中，以95%乙醇脱脂24小时。脱脂后挥尽乙醇的露蜂房碎块，于4℃蒸馏水中冷浸三次，每次24小时。合并提取液，过滤、减压浓缩后冷冻干燥。 2.2水提物的粗分离将露蜂房的水提物上样于Sephadex G50层析柱，以水为洗脱液，柱上分离为6条色带，收集色带3部分。减压浓缩后冻干。以0.01MpH=6.8磷酸缓冲液预平衡DEAESephadex A50柱，然后将带3样品上柱，顺序以0.01M→0.05M→0.1M→0.2M磷酸缓冲液进行梯度洗脱，收集0.2M洗脱部分，减压浓缩、透析、冻干。 2.3 NV-PP-4的分离纯化 2.3.1 Sephadex G75柱层析将0.2M磷酸缓冲液洗脱部分上样于Sephadex G75柱，以0.1M NaCl洗脱，收集峰2的峰尖部分，浓缩、透析、冻干。 2.3.2 羟基磷灰石柱层析取峰2上样于羟基磷灰石柱，依次用H2O→0.005M→0.01M→0.05M→0.1M→0.2M的NaH2PO4Na2HPO4(pH=6.4)缓冲液洗脱。收集H2O洗脱的样品，浓缩、冻干。 2.3.3 HPLC进一步纯化使用排阻极限为100KD的TSK 2000SW柱对羟基磷灰石柱H2O洗脱的样品进一步纯化。采用Gilson高压液相系统，以0.9%NaCl为洗脱液，其吸收峰如图1所示，收集保留时间Tr=10.09的峰。透析脱盐后，再次上TSK柱进行纯化，洗脱液为1.5%NaCl，收集所示峰尖部分，透析、冻干，即得NV-PP-4。 载脂蛋白分离纯化采用SephadexG-200层析分离 ApoAⅠ、AⅡ的凝胶过滤分离纯化法：1.超速离心获得HDL，以醇：醚（1：1）脱脂，-10℃脱脂6～8h，离心，弃上清留沉淀； 2.以6mol/L尿素Tris-HCl缓冲液(0.1mol/L,pH8.5)溶解沉淀； 1.?加样于SephadexG200凝胶柱。以6mol/L尿素Tris-HCl缓冲液(0.1mol/L,pH8.5)洗脱； 2.?洗脱液经紫外监测仪（280nm）监测后，由部分收集器按吸收峰分部收集。 5. 对各组份进行鉴定，收集需要的蛋白峰，透析，浓缩。 ApoE、CⅡ、CⅢ均以VLDL为材料，与ApoAⅠ类同的方法进行凝胶层析分离。 亲和层析纯化法 载脂蛋白纯化的常用方法是溴化氰偶联法，其操作过程包括： ①活化，取一定的贮存载体Sepharose 4B用布氏漏斗抽干，加入等量的蒸馏水，并与等量的2mol/L的Na2CO3溶液（pH11～12）混匀。另取固体CNBr50～300mg/g贮存胶溶于二甲基甲酰胺溶液中，随后迅速加到搅拌的Sepharose 4B悬浮液内进行活化，其pH始终保持11～12范围。反应过程中因为放热，故要用碎冰置于反应杯周围控制温度在20℃左右，维持8～10min后再加碎冰，使其反应物温度制冷至4℃或更低的温度。由于活化的Sepharose 4B破坏迅速，他的半寿期在4℃约为15min，故整个操作过程必须迅速进行，以期尽快完成。将活化的Sepharose 4B反应液迅速转到布氏漏斗中，用10～20倍凝胶体积的预冷水及0.07mol/L溶液（pH8.3）洗涤。 ④亲和层析：将制备好的吸附剂CNBr-Sepharose-4B-配体（抗人ApoB100-IgG）悬浮于平衡缓冲液中，然后加到装有平