第六章 色谱技术--6(1).pptVIP

生物工程下 游 技 术 二、凝胶介质应具备的条件 1.应为惰性物质，不与溶质、溶剂分子发生作用。 2.尽量减少介质内含的带电离子基团，以减少非特异吸附。 3.介质内孔径大小要分布均匀。 4.凝胶颗粒粒径的均一性要好。 5.要具有良好的稳定性及较高的机械强度，易于消毒，寿命长。 天然凝胶 琼脂和琼脂糖凝胶 （Sepharose）：能分离较大相对分子质量的物质，但它带有大量的电荷，层析时需使用较高离子强度的洗脱液 人工合成凝胶 1.聚丙稀酰胺凝胶（Bio－Gel P） 2.交联葡聚糖凝胶（Sephadex） 商品名：Sephadex 吸水值：1克干胶在完全膨胀后凝胶颗粒所吸取的水量。G–75以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶。 G–75以下的称为硬胶。 琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，可以分离葡聚糖凝胶和生物胶所不能分离的大分子，其工作范围的下限几乎是 Sephadex的上限, 因此可用来分离核酸及病毒。 1.结构 是由β-D-吡喃半乳糖和3，6脱水-L-吡喃半乳糖相结合的链状多糖。 琼脂糖 一些Sepharose凝胶的特性 装柱 1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。 2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。 凝胶柱的平衡 通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。 加盖，并接上贮液瓶，开始滴注洗脱平衡液（本实验用蒸馏水，含5%的乙醇）。至少要滴注2个柱床体积的洗液，使胶床稳定。并检查柱子装得是否均匀、有无断层，有无汽泡（若有需重装）。 部分收集器 加样 1.准备好部分收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪 2.打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切。沿管壁将样品溶液小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。 按加样操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次。最后加入3－4 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒压瓶，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连。 洗脱： 借助重力洗脱即可，洗脱时要控制流速为4m1/15min。收集时用自动部分收集器收集，每管4m1，洗脱物各组分收集根据核蛋仪及层析图谱仪的数据与流速共同来决定（若无采集图谱时，还需要在分光光度计上测定A28O来定）。 注意事项 1.各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。 2.装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。 3.始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。 核酸蛋白检测仪 记录仪 部分收集器 BS－100自动部分收集器 返回 新柱装好后，要用洗脱缓冲液平衡，一般用3～5倍体积的缓冲液在恒压下流过柱床。 新装好的柱要检验其均匀性：可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液过柱，观察色带是否均匀下降。也可以对光检查，看其是否均匀或有无气泡存在。 （三）加样 由于凝胶层析的稀释作用，似乎样品浓度应尽可能大才好，但样品浓度过大往往导致粘度增大，而使层析分辨率下降。对蛋白质类样品浓度以不大于4％为宜。如果样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后上柱。 样品黏度对洗脱曲线的影响 （1）加葡萄糖2 000，使终浓度为5% （2）加葡萄糖2 000，使终浓度为2.5% 样品黏度对洗脱曲线的影响 （3）加葡萄糖2 000，使终浓度为1%. （三）加样 分析用量一般为每100mL床体积加样品1～2mL，制备用量一般为每100 mL床体积加样品20～30 mL，这样可使样品的洗脱体积小于样品各组分之间的分离体积，获得较满意的分离效果。 样品上柱是凝胶层析中最关键的一步。理想的样品色带应是狭窄且平直的。为了做到这一点，应尽量减少加样时样品的稀释以及样品的非平流流经凝胶层析床体。反之将造成色谱带扩散、紊乱，严重影响分离效果。 加样时应尽量减少样品的稀释，及凝胶床面的搅动。这一点