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* SDS测量蛋白质分子量 EXPERIMENT 7 实验目的 学习聚丙烯酰胺凝胶聚合原理； 学习不连续聚丙烯酰胺凝胶分离原理； 掌握垂直板电泳的操作方法； 学习SDS测蛋白分子量原理并测定。 聚丙烯酰胺凝胶电泳— PAGE (Polyacryamide gel electrophoresis) 支持介质－聚丙烯酰胺凝胶 聚合原理： 单体丙烯酰胺Acr 交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺Bis 化学聚合 光聚合 引发剂 （NH4)2S2O8 （NH4)2S2O8 核 黄 素 加速剂 TEMED DMAPN TEMED 注：（NH4)2S2O8 过硫酸胺在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递，使丙烯酰胺 成为自由基，发动聚合反应 TEMED N，N，N?，N?-四甲基乙二胺 DMAPN β－二甲基胺基丙晴 影响聚合因素 大气中氧能淬灭自由基，使聚合反应终止，所以在聚合过程中要使反应液与空气隔绝。 某些材料如有机玻璃，能抑制聚合反应。 某些化学药物可以减慢反应速度，如赤血盐。 温度高聚合快，温度低聚合慢。 碱性条件下凝胶易聚合，其聚合速度与AP浓度的平方根成正比。 聚丙烯酰胺凝胶优点 化学性质稳定；凝胶孔径可调； 重复性好；分辨率高； 灵敏度高，可以测定10-6浓度的样品。 凝胶浓度的计算 聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T和C，T是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分浓度。T与C的计算公式是： 上式中a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，m为水或缓冲液体积（ml）。式中a与b的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30左右。 ） 分子量范围与凝胶浓度的关系 物 质 分子量范围 适用的凝胶浓度（%） 蛋白质 104 1-4×104　4×104-1×105 1-5×105 5×105 20-30 15-20 10-15 5-10 2-5 核酸 104 104-105105-2×106 10-20 5-102-2.5 5% 10% 15% 29 45 66 97 200 29 45 66 97 200 29 45 66 97 200 5 7 9 11 13 15 T% A B 凝胶浓度T对样品迁移率的影响 例：混合蛋白质A,B，A分子量较小，B分子带电荷较多，T＝5％时，电泳行为主要以电荷起作用，B 迁移速度快。当 T 增加，分子筛效应增加，B的迁移速度减慢；T＝ 9 ％时，A，B的迁移率相同，不能分开，T 再增加，凝胶孔径更小，A分子比B分子小，表现较高的迁移率。并且说明电泳只获得单一的带时，并不能证明是单一的均一成分。 迁移率 不连续凝胶电泳（disc）的分离原理 (一).原理 不连续凝胶电泳系统具有与一般电泳的① 电荷效应分离外，还具有②浓缩效应与③分子筛效应，因而，能提高电泳的分辨率；使电荷性质与密度相近的但分子量有差别的分子得以分离；或分子量相近、性质一样、电荷性质与密度有差别的分子可以分离；或电荷性质、分子量大小相近，但构型不同时亦可分离。 不连续凝胶电泳洗脱 碱性不连续－分离酸性样品 酸性不连续－分离碱性样品 大多数蛋白质分子呈酸性或中性，适合用碱性系统进行电泳分离。 ①浓缩效应 1.凝胶的组成：浓缩胶为大孔径（稀） T＜5％，分离胶一般为小孔径（浓）T﹥7.5％。样品在较稀的凝胶上自由迁移，直至浓凝胶时，便形成一道栅栏，所有的样品分子在浓缩胶的界面堆积成一窄带，得到浓缩，然后，再依据分子量的大小进行电泳分离。 2.缓冲液的组成:图示。PH系统的不连续，各种分子的电荷之间的差异进行分离。 3.缓冲体系的不连续，其中各组成的离子、快慢离子迁移快慢的差别是影响样品浓缩效应的重要因素。 4.离子的迁移速率及浓度的不连续又造成电场强度与电导率的变化。 ②分子筛效应 移动界面到达浓缩胶和分离胶界面时，凝胶的PH变化明显，缓冲液中甘氨酸的解离迅速增加，直至完全解离出 gly-,其分子量小，迁移超过蛋白质分子。而丧失夹击的作用；同时，凝胶的孔径变小，降低了蛋白质的迁移率。故蛋白质分子在均一的电压梯度和PH 值中泳动，依其分子量的大小而分开。 ③电荷效应 操作 垂直柱状，板状的不连续凝胶电泳系统的组成和配制； 均一凝胶与梯度凝胶配制； 电极缓冲液系统； 样品的准备； 加样要求 电泳 检测 PH8.3 PH6.7 PH8.9 PH8.3 垂直柱状，板