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第一章 生命大分子物质制备 Preparation of Life-Molecules 一、生命大分子的概念 生命大分子是指生物机体（动物、植物和微生物）经过新陈代谢产生的蛋白质（多肽、酶类）核酸、糖类以及它们的复合物。 二、生化分离制备方法基本原理 各种方法的基本原理基本上可归纳为两个方面： 1、根据混合物中几个组分分配系数的差别将它们分配于两个或几个物相中（如有机溶剂抽提、盐析、层析、结晶等）。 2、将混合物置于某一物相中（固相或液相）外加一定的作用力，使各种成份分配于不同区域，达到分离目的（如电泳、离心、超滤等）。 三、生化分离制备方法的特点 1、生物材料存在的状态多样性：结合态、混合物、游离形式、分泌型。 2、生物材料组成非常复杂，不断代谢变化。 3、有效成份在材料中含量极微。 4、生物材料离体后丧失生理活性。 5、分离制备的溶液各种参数难以控制。 6、一般采用温和的、多阶式程序。 7、材料来源、含量、存在状态、稳定性的差异，制备方法的通用性差。 四、生物大分子分离提纯的基本程序 1、前处理：将欲分离的生物大分子组分从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来。 2、粗分级：选用一套适当的方法，将所要的成分与其他的杂质成分分离开来。 3、细分级：将粗分级后的样品进一步地提纯。 4、结晶：样品（如蛋白质）分离纯化的最后步骤及最终结果。 生物大分子分离纯化的一般步骤 四、生物物质制备的基本过程 材料的选择与处理 确定测定方法 有效成份的抽提 粗制品的纯化 纯化产品的分析与鉴定（定性与定量） 一、有效成份：指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。 二、选材的原则：遵循有效成份含量多、稳定性好；来源丰富；提取工艺简单；有综合利用价值等原则。 三、材料的处理：目的是去除影响有效成份的杂质，要求保持材料的活力，保持提取率高。 材料的处理方法 （一）动物脏器的处理： 1.冰冻：去除脂肪及结缔组织，迅速冰冻； 2.干燥：经过脱水、干燥条件下保存样品； （二）植物组织：除腊去油脂，低温储藏－4～－30℃； （三）细胞、微生物：离心法收集菌体后，再进行后续处理；分泌型的表达蛋白质、胞外酶则离心弃菌体后对上清液的后续处理。 一、目的要求 追踪有效成份的去向，建立快速、特异、准确、灵敏、简便及重复性好的方法，并经济的、能在小体积内进行操作，尽量不需用昂贵的仪器。 二、方法 定性和定量；或是为了求得更多更纯的产品；或是为了获得新的物质。 1、生物测定方法： 全面涉及生物学各科的实验内容 2、理化测定方法：色谱法、光谱法、电泳法、电化学法 三、常用的测定方法 （一）光谱法 1.吸收光谱法：测定核酸含量；测定蛋白质的含量及纯度。 2.荧光法：在生化反应进行中含量低，吸收光谱法检测不到时应用。 3.浊度法：悬浮液样品、培养液中细菌生长的浓度测定。 （二）电化学法 （三）生物活性检测法 （四）免疫分析法 定义：在不破坏有效成份的条件下，采用适当的生物学、化学、物理学的方法，对动物、植物、微生物的组织或细胞结构进行破碎加工，除去任何不想要的组织与成份，以便提取生物活性成份的过程。 细胞破碎的方法介绍 一、机械破碎 1.研磨法 将剪碎的动物组织置于研钵中，加入少量石英砂研磨 2.组织捣碎器法 较剧烈，用10000－20000r/min的内刀式组织捣碎机将组织的细胞打碎 3.压榨法 条件温和，彻底破碎细胞，用1.77－3.54×108 Pa的压力迫使几十毫升细胞悬液通过一小孔 4.匀浆法